RNA結(jié)合蛋白QKI在化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的，程序性死亡過(guò)程，作為一種機(jī)體廣泛存在的生物學(xué)行為，參與了發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激和腫瘤等眾多生理和病理學(xué)過(guò)程。凋亡信號(hào)通路通常分為胞外配體途徑和胞內(nèi)應(yīng)激信號(hào)途徑。胞外配體如Fas、TNFα和TRAIL等，結(jié)合胞膜上的相應(yīng)受體，使得受體胞內(nèi)段募集接頭蛋白（FADD和TRADD等）和凋亡起始者的Caspase-8,-10，這些分子組成了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC），進(jìn)一步活化下游的凋

2、亡效應(yīng)者Caspase-3,-6,-7，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡。胞內(nèi)應(yīng)激信號(hào)，如生長(zhǎng)因子的撤除、DNA損傷、氧化應(yīng)激和癌基因的激活等，可導(dǎo)致線粒體外膜的泄露，細(xì)胞色素C的釋放并引發(fā)凋亡小體的產(chǎn)生，其組成包括細(xì)胞色素C、Apaf-1和Caspase-9。作為凋亡起始者Caspase-9的激活，可進(jìn)一步活化下游的凋亡效應(yīng)者Caspase-3,-6,-7，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡。因其信號(hào)通路眾多，且相互影響，細(xì)胞內(nèi)對(duì)凋亡的調(diào)控就更加復(fù)雜。
　　近年

3、來(lái)，由RNA結(jié)合蛋白和miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控越來(lái)越受到人們的重視，已有報(bào)道稱細(xì)胞凋亡過(guò)程中該調(diào)節(jié)方式扮演重要作用。我們課題組一直關(guān)注的QKI就是一類(lèi)RNA結(jié)合蛋白，屬于STAR(signaltransductionandactivationofRNA)家族，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中參與髓鞘發(fā)育。除了在神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)于髓鞘的形成發(fā)揮重要功能以外，QKI蛋白在血管發(fā)生、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)形成和器官發(fā)生等方

4、面具有舉足輕重的功能。由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同剪接，QKI有3種亞型，分別為QKI-5/6/7，差別主要集中在它們C末端和3’非翻譯區(qū)的不同。其中QKI-5包含了一段核定位信號(hào)肽，因此主要定位于胞核中，但也可在胞核與胞漿中穿梭；而QKI-6和QKI-7則定位于胞漿中。這一差別決定了各自的亞細(xì)胞定位和功能有所不同。根據(jù)QKI與RNA結(jié)合的序列特異性，對(duì)整個(gè)mRNA進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)：QKI可能調(diào)控的下游靶基因中有眾多如Bid、FOXO1、Sirt1等

5、參與凋亡調(diào)節(jié)過(guò)程的重要基因，高度提示QKI可能在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。
　　本研究通過(guò)RealtimePCR、WesternBlotting和啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)觀察了化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡模型中QKI的表達(dá)變化，并通過(guò)PARP檢測(cè)、AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)和ROS檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)研究了QKI表達(dá)變化對(duì)凋亡的影響，最后探討了QKI表達(dá)變化對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡影響的相關(guān)機(jī)制。
　　本研究的初步結(jié)論

6、如下：
　　1.構(gòu)建并改造了QKI的顯性負(fù)突變體，這一突變體包含二聚體形成序列但沒(méi)有RNA結(jié)合功能。同時(shí)我們利用QKI異構(gòu)體細(xì)胞定位的不同，在顯性負(fù)突變體C端融合表達(dá)了QKI-5的核定位信號(hào)，通過(guò)與QKI-5的共定位實(shí)現(xiàn)了針對(duì)QKI-5亞型的特異性功能抑制。
　　2.利用ViraPower?腺病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了可表達(dá)QKI-6的重組腺病毒表達(dá)載體，并包裝出高滴度的重組腺病毒。
　　3.觀察到在3種不同的化療藥物誘導(dǎo)

7、的Hela細(xì)胞凋亡模型中，隨著凋亡的增加QKI的mRNA和蛋白表達(dá)水平都逐漸降低，通過(guò)QKI啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)、QKImRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和蛋白酶體抑制實(shí)驗(yàn)證明，QKI表達(dá)的下調(diào)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平；
　　4.在細(xì)胞水平過(guò)表達(dá)QKI-5蛋白后，表柔比星和順鉑誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡比例明顯減少；相反，在細(xì)胞水平過(guò)表達(dá)QKI-7蛋白后，表柔比星和順鉑誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡比例明顯增多；同時(shí)，在細(xì)胞水平過(guò)表達(dá)QKI-6蛋

8、白后，表柔比星和順鉑誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡比例無(wú)明顯變化。在主要表達(dá)QKI-5的Hela細(xì)胞中降低QKI所有異構(gòu)體表達(dá)，可觀察到表柔比星和順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比例明顯增多。
　　5.在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，過(guò)表達(dá)QKI-7后，Hela細(xì)胞ROS的產(chǎn)生增高約1.4倍，而在阿霉素或順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，這種增高提高到了約3倍，表明QKI-7有促進(jìn)ROS生成的作用，尤其是在化療藥物誘導(dǎo)的應(yīng)激條件下，這種效應(yīng)更加明顯。在QKI-5抗凋亡作用機(jī)制

9、研究中，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a3’UTR存在QKI反應(yīng)元件。Westernblotting檢測(cè)也觀察到在順鉑刺激條件下，伴隨著QKI-5表達(dá)的降低，F(xiàn)OXO3a的表達(dá)增高。在Hela細(xì)胞中過(guò)表達(dá)QKI-5可導(dǎo)致FOXO3a的表達(dá)降低，降低QKI的表達(dá)可引起FOXO3a的表達(dá)增高，這些都提示FOXO3a參與了QKI-5的凋亡調(diào)節(jié)效應(yīng)。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，本課題組首次發(fā)現(xiàn)在化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)