Th17細(xì)胞在蛔蟲抗原誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的探討.pdf

1、目的:
　　探討Th17細(xì)胞在蛔蟲抗原誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞(A549)凋亡中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、蛔蟲抗原誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
　　(1)蛔蟲抗原的制備:將人蛔蟲蟲體制成勻漿,經(jīng)10,000rpm離心30min,去除組織糜沉淀及大分子蛋白,取上清過0.4μm濾膜除菌,用核酸/蛋白分析儀檢測其蛋白濃度,并排除內(nèi)毒素污染后,分裝后置-30℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　(2)腫瘤細(xì)胞株的培養(yǎng):A549細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后,用含1

2、0％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml,置37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞至對數(shù)生長期時(shí)用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。
　　(3)細(xì)胞活性檢測:取對數(shù)生長期 A549細(xì)胞,經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液,加入96孔板,每孔10,000個(gè)細(xì)胞,置37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,然后加入不同濃度蛔蟲抗原分別培養(yǎng)18h和24h,加入10μl CCK-8,培養(yǎng)2-3h,酶標(biāo)儀檢測

3、OD450值。根據(jù)OD450值確定抗原作用濃度及時(shí)間。
　　2、細(xì)胞凋亡和周期的檢測
　　(1)T細(xì)胞制備和鑒定:取健康人全血用淋巴細(xì)胞分離液分離,吸取淋巴細(xì)胞層后用無血清RPMI1640洗滌2次,用含5%FBS的RPMI1640重懸細(xì)胞,過尼龍毛柱。過尼龍毛柱后的細(xì)胞加入相對應(yīng)量的 anti-CD3 FITC、anti-CD4 APC、anti-CD8 PE、anti-CD45 PerCP避光孵育15min,流式檢測T細(xì)胞

4、純度, CD3、CD4以及CD3+CD8+表達(dá)為T細(xì)胞。
　　(2)細(xì)胞凋亡率檢測:A549細(xì)胞組和A549細(xì)胞+T細(xì)胞共培養(yǎng)組培養(yǎng)4h后,加入不同濃度的蛔蟲抗原(25μg/ml、125μg/ml、500μg/ml)分別作用1h、18h、24h后收集細(xì)胞。用4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次,加入1.25μl Annexin V-FITC,常溫避光孵育15min后離心,加入PI10μl,上流式細(xì)胞儀檢測。
　　(3)細(xì)胞周期檢測:

5、細(xì)胞培養(yǎng)4h后,加入125μg/ml的蛔蟲抗原與A549細(xì)胞作用18h后,收集細(xì)胞,預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次,70%乙醇4℃固定過夜,加入300μl配制備好的染液避光孵育30min,上流式細(xì)胞儀檢測。
　　3.細(xì)胞因子表達(dá)的檢測
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為5組,分別為組①:A549細(xì)胞+培養(yǎng)基;組②:A549細(xì)胞+T細(xì)胞;組③:A549細(xì)胞+蛔蟲抗原;組④:蛔蟲抗原+T細(xì)胞;組⑤:A549細(xì)胞+蛔蟲抗原+T細(xì)胞。蛔蟲抗原分

6、別設(shè)定低、中、高三個(gè)劑量濃度。
　　(2)Transwell小室共培養(yǎng):組②A549細(xì)胞+T細(xì)胞和組⑤A549細(xì)胞+蛔蟲抗原+T細(xì)胞采用Transwell小室共培養(yǎng)體系,將上室加入T細(xì)胞下室加入A549細(xì)胞T細(xì)胞、A549細(xì)胞密度比為15:1。使細(xì)胞之間自身并不接觸,而細(xì)胞之間的影響只通過細(xì)胞因子之間的傳遞。
　　(3)ELISA檢測細(xì)胞因子:收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清,使用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-

7、23和TGF-β。
　　(4)熒光定量 PCR:分別提取各組細(xì)胞的總 RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNAs,用Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System檢測cDNAs特異性引物IL-6、IL-17、IL-23和TGF-βmRNA表達(dá)。用SYBR Premix Ex Taq I kit檢測目的產(chǎn)物,實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系為:95℃、30S;(95℃、5S;60℃、34S)×40個(gè)循環(huán)95℃、1

8、5S;60℃、1min;95℃、15S。計(jì)算相對表達(dá)值。
　　4.數(shù)據(jù)處理
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示,小樣本數(shù)據(jù)采用Lg10轉(zhuǎn)換,實(shí)驗(yàn)組與對照組的組間差異比較采用one-way ANOVA與t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞毒性檢測:取細(xì)胞存活率大于50%為誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的濃度?；紫x抗原濃度為125μg/ml時(shí),細(xì)

9、胞抑制率34%,為所有作用濃度最高,且與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。故取蛔蟲抗原低、中、高濃度分別為25μg/ml、125μg/ml、500μg/ml。
　　2、細(xì)胞凋亡率檢測:蛔蟲抗原125μg/ml濃度處理組在18h時(shí),細(xì)胞早期凋亡率(37.80?1.70)%顯著高于對照組(7.25?0.50)%;而與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的蛔蟲抗原125μg/ml濃度處理組在18h時(shí),細(xì)胞早期凋亡率則由(37.80?1.70)%下

10、降到(7.20?0.57)%。
　　3、A549細(xì)胞周期檢測:蛔蟲抗原125μg/ml濃度處理組在18h時(shí),細(xì)胞周期G1/S占8.18,顯著高于陰性對照G1/S的4.57。
　　4、細(xì)胞因子表達(dá)檢測:
　　1) ELISA檢測:在同一時(shí)間段內(nèi),當(dāng)蛔蟲抗原濃度增加時(shí),除TGF-β外,其他細(xì)胞因子的表達(dá)水平都隨著濃度的增加而升高,且都有顯著性差異(P<0.05)。在同一濃度下,除 TGF-β外,其他細(xì)胞因子的表達(dá)水平都隨著

11、蛔蟲抗原作用時(shí)間的延長而降低,存在顯著性差異(P<0.05)。TGF-β則在各時(shí)間段和各濃度區(qū)間內(nèi)無明顯趨勢。
　　2)熒光定量PCR:各實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞的IL-6、IL-17和TGF-β mRNA水平都在18h達(dá)到高峰,且都與空白對照組存在差異性(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞的IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β mRNA水平也在同一作用時(shí)間段達(dá)到最高,且與對照組存在差異性(P<0.05)。
　　結(jié)論: