Th17細胞在骨髓增生異常綜合征發(fā)病機制中的作用.pdf

1、目的：通過檢測不同危度骨髓增生異常綜合征患者及健康人體內(nèi)Th17細胞及其相關(guān)細胞因子在外周血及骨髓中的表達水平，分析 Th17細胞數(shù)量與 MDS患者血液學(xué)指標之間的相關(guān)性，體外研究重組人IL-17刺激前后MDS患者骨髓單個核細胞中 CD3+CD8+細胞相關(guān)效應(yīng)分子表達水平的變化，進而探索并闡明Th17細胞在MDS發(fā)病機制中的作用。
　　背景：骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndromes，MDS)是血液系統(tǒng)

2、常見的惡性病之一，是一組以骨髓無效造血和病態(tài)造血、進展性骨髓衰竭并伴有遺傳學(xué)及分子學(xué)異常且不同風(fēng)險向急性白血病轉(zhuǎn)化為特點的異質(zhì)性疾病，也是起源于造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病。大量研究表明 T淋巴細胞數(shù)量及功能的異常在其發(fā)病機制中起重要作用，我們實驗組前期研究發(fā)現(xiàn)MDS患者體內(nèi)輔助性T細胞Th1、Th2及二者比值、NK細胞、調(diào)節(jié)性T細胞均出現(xiàn)數(shù)量和（或）功能上的異常。Th17細胞是一種近年發(fā)現(xiàn)的輔助性T細胞家族中的一員，維甲酸相關(guān)孤核受體γt

3、(Retinoid-related Orphan nuclear Receptorγt, RORγt)是其進行分泌活動的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Th17細胞的命名由其特異性分泌的IL-17而來，同時其增殖、分化及分泌功能受IL-23、IL-6及信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3( Signal Transducer and Activator of Transcription-3,STAT-3)調(diào)控。Th17細胞在炎癥性疾病及自身免疫性疾病中扮演重要角色已

4、在大量文獻數(shù)據(jù)中得到證實。近幾年，相關(guān)研究陸續(xù)證實了Th17細胞在惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，但其究竟發(fā)揮抗腫瘤免疫作用還是發(fā)揮促進腫瘤生長的作用及通過何種途徑發(fā)揮作用尚存在爭議。MDS作為一種常見的惡性血液系統(tǒng)疾病，Th17細胞在其發(fā)病機制中的作用罕有研究。因此，本研究將MDS患者分為低危組MDS(low risk MDS, L-MDS,包括低危及中危-1MDS患者)和高危組MDS(high risk MDS, H-MDS,包括中危-2和

5、高危MDS組)兩組，通過檢測L-MDS和H-MDS患者及健康對照者Th17細胞及其相關(guān)細胞因子在外周血及骨髓中的表達水平，分析Th17細胞數(shù)量與MDS患者的血液學(xué)指標之間的相關(guān)性，并應(yīng)用重組人 IL-17（human recombinant IL-17, rhIL-17）刺激MDS患者骨髓單個核細胞進而檢測刺激前后CD3+CD8+細胞相關(guān)效應(yīng)分子表達水平的變化，進而探索并闡明Th17細胞在MDS發(fā)病機制中的作用。
　　材料與方法：

6、我們首先應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測35名MDS患者（L-MDS患者18名，H-MDS患者17名）和18名健康對照（healthy control, HC）外周血及骨髓中以CD3+CD4+IL-17+為流式標記的Th17細胞比例（Th17細胞/CD3+CD4+細胞），進而應(yīng)用定量方法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測42例MDS患者和23名健康人細胞因子IL-17、IL-6、IL-23在外周血血漿及骨髓上清中的濃度；提取外周血單個核細胞（peripheral

7、blood mononuclear cell, PBMNC）及骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cell, BMMNC)中的總 mRNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA,采用SYBRGreenII實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT- PCR）檢測與Th17相關(guān)的效應(yīng)分子IL-17及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt、STAT-3 mRNA的表達水平以評估Th17的功能和激活狀態(tài)，將Th17細胞數(shù)量與MDS患者血液學(xué)指標做相關(guān)性分析

8、。以rhIL-17模擬體內(nèi)IL-17作用，體外刺激MDS患者BMMNC并檢測刺激前后CD3+CD8+細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)中細胞毒性顆粒穿孔素(Perforin， Per)、顆粒酶(Granzyme B,GB)及凋亡配體FasL表達率的變化，探索并闡明Th17細胞在MDS患者發(fā)病機制中的作用。
　　結(jié)果：
　　1. L-MDS組患者PB中Th17細胞比例（4.42±2.59％）明顯高于

9、HC組（2.73±1.32%,P=0.006）及H-MDS組(1.42±0.79%, P<0.001)，同時H-MDS組Th17細胞比例明顯低于HC組（1.42±0.79% vs2.73±1.32%, P=0.032); L-MDS組患者BM中Th17細胞比例(4.32±2.76%）顯著高于HC組(2.93±1.21%，P=0.018）及H-MDS組（1.37±0.84%, P<0.001），后兩者之間比較亦具有顯著性差異（2.93±1

10、.21%vs1.37±0.84%, P=0.02)。L-MDS組患者PB中Th17細胞占T淋巴細胞的比例(2.12±0.90%）明顯高于HC組(1.47±0.63%,P=0.011）及H-MDS組(0.92±0.63%, P<0.001)，同時H-MDS組Th17細胞占T淋巴細胞的比例明顯低于HC組（0.92±0.63%vs1.47±0.63%,P=0.031)；L-MDS組患者BM中Th17細胞占T淋巴細胞的比例(2.26±1.05%

11、）顯著高于HC組(1.56±0.63%，P=0.014）及H-MDS組（1.04±0.69%, P<0.001），后兩者之間比較亦有顯著性差異(1.56±0.63%vs1.04±0.69%, P=0.029)。染色體正常組MDS患者BM中Th17細胞比例（4.559±2.6839%）較異常組（1.343±0.651%）明顯升高（P<0.001）, PB中 Th17細胞比例染色體正常與異常組比較亦有顯著差異（4.631±2.519% vs

12、1.399±0.748%, P<0.001）；染色體核型好、中、差3組PB中Th17細胞比例分別為4.591±2.605%、2.450±1.217%、0.913±0.363%，兩兩比較P值均小于0.05， BM中 Th17細胞比例分別為4.686±2.661%、2.921±0.933%、0.882±0.441%，兩兩比較P值均小于0.05；L-MDS組患者PB中Th17比例與中性粒細胞絕對值（Absolute Neutrophil Co

13、unt, ANC）、血紅蛋白（Hemoglobin，Hb)濃度均呈正相關(guān)（r=0.731,P=0.006; r=0.492,P=0.038），L-MDS組患者BM中Th17細胞比例與ANC、Hb濃度亦呈正相關(guān)（r=0.866,P<0.001; r=0.478,P=0.045）；MDS患者 BM及 PB中 Th17細胞比例與患者 BM涂片中原始細胞比例呈負相關(guān)(r=0.7936,P<0.001；r=0.7936, P<0.0001)

14、>　　2. H-MDS組患者 PB血漿中IL-17濃度(22.44±5.64pg/ml)明顯低于L-MDS組（30.29±5.97pg/ml, P<0.001）及HC組（28.11±4.64pg/ml，P=0.01）；H-MDS組患者BM中IL-17濃度(131.67±49.71pg/ml)明顯低于L-MDS組（199.71±61.49 pg/ml，P<0.001）及HC組（173.59±52.70pg/ml，P=0.015）；H-MD

15、S組患者PB血漿中 IL-23濃度(42.77±13.35 pg/ml)明顯低于 L-MDS組（66.21±20.54 pg/ml, P<0.001）及HC組（54.20±15.40 pg/ml, P=0.030），后兩組比較P=0.019，H-MDS組患者BM中IL-23濃度(77.75±30.01pg/ml)明顯低于L-MDS組（137.54±47.32 pg/ml, P<0.001）及HC組（106.96±36.69 pg/ml,

16、 P=0.011），后兩組比較P=0.017，亦有統(tǒng)計學(xué)意義；H-MDS組患者 IL-6(4.152±2.497pg/ml)明顯低于 L-MDS組（7.834±3.977pg/ml,P=0.001）及HC組（6.377±3.578 pg/ml，P=0.038）, H-MDS組患者 BM中 IL-6濃度(10.467±5.131pg/ml)明顯低于 L-MDS組（17.659±5.874pg/ml,P<0.001）及 HC組（14.550

17、±4.483pg/ml，P=0.012），L-MDS與對照組濃度比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.049)。
　　3. L-MDS組患者PBMNC中IL-17的 mRNA相對表達量(11.81±4.77）明顯高于HC組(7.46±3.05, P=0.021）及H-MDS組(4.72±2.91，P<0.001)，同時HC組與H-MDS組之間存在顯著性差異（4.72±2.91 vs7.46±3.05,P<0.001)；同樣，L-MDS組

18、患者BMMNC中IL-17 m RNA的相對表達量(10.66±3.18）顯著高于HC組(8.78±2.84,P=0.035）及H-MDS組（5.00±2.76,P<0.001)，后兩者之間比較亦存在顯著性差異(8.78±2.84 vs5.00±2.76, P<0.001)。L-MDS組患者PBMNC中RORγt mRNA的相對表達量(0.201±0.084）明顯高于HC組(0.148±0.069,P=0.016）及H-MDS組(0.1

19、00±0.063,P<0.001)，同時H-MDS組與HC組之間存在顯著性差異（0.100±0.063 vs0.148±0.069,P=0.034)；與PB一致， L-MDS組患者BMMNC中RORγt mRNA的相對表達量(0.406±0.180）顯著高于HC組(0.319±0.127,P=0.046）及H-MDS組（0.187±0.097，P<0.001），后兩者之間比較亦存在顯著性差異(0.319±0.127 vs0.187±0.

20、097, P=0.003)。L-MDS組患者PBMNC中STAT-3 mRNA的相對表達量(0.316±0.132）明顯高于HC組(0.240±0.123, P=0.032）及H-MDS組(0.165±0.083，P<0.001)，同時H-MDS組與HC之間存在顯著性差異（0.240±0.123vs0.165±0.083,P=0.037)；L-MDS組患者BMMNC中STAT-3 mRNA的相對表達量(0.416±0.126）顯著高于H

21、C組(0.329±0.146，P=0.042）及H-MDS組（0.225±0.087,P<0.001)，后兩者之間比較差異亦有顯著性(0.329±0.146 vs0.225±0.087, P=0.004)。
　　4. L-MDS組、H-MDS組患者CTL占BMMNC百分比低于HC組(16.285±9.426% vs22.382±8.628%，15.589±7.906% vs22.382±8.628%,P值均小于0.05），L-MD

22、S與H-MDS兩組間比較無顯著差異( P=0.814>0.05）；與CTL占單個核細胞百分比結(jié)果一致，L-MDS組、H-MDS組患者BM中CTL細胞占T淋巴細胞百分率低于 HC組(37.209±12.213% vs46.759±14.439%，35.990±10.332%vs46.759±14.439%, P值均小于0.05），L-MDS與H-MDS兩組間比較亦無顯著差異（P=0.077>0.05圖4.3)。MDS患者BM中CTL細胞P

23、er、GB、FasL表達率與患者 BM中原始細胞比例呈負相關(guān)（r=-0.5443, P=0.0007; r=-0.6022, P=0.0001;r=-.5329, P=0.001），且與H-MDS組比L-MDS組CTL中Per、GB、FasL表達率均顯著升高(4.607±3.560%vs2.373±2.290%, P=0.035;47.324±16.940%vs34.270±18.947%, P=0.039;14.570±7.894%v

24、s9.391±6.378%，P=0.041)。MDS患者BM中CTL的Per、GB、FasL表達率與患者BM上清中IL-17濃度呈正相關(guān)（r=0.4012, P=0.0169;r=3685, P=0.0294;r=0.5388, P=0.0008)。rhIL-17刺激后BM中 CTL的 Per、GB及 FasL表達率均較刺激前明顯升高（4.56±4.23% vs3.52±3.17%,P<0.01;59.47±16.47% vs40.61

25、±18.98%, P<0.01;13.94±10.58%vs12.11±8.69%, P<0.05）。L-MDS與H-MDS組患者刺激前后Per、GB、FasL表達率比值無顯著性差異（P值分別為0.161,0.27,0.98)，同時刺激后H-MDS組與刺激前 L-MDS組 Per、GB、FasL表達率比較無差異（ P值分別為0.567,0.451,0.482）。
　　結(jié)論：（1）Th17細胞在MDS發(fā)病中主要通過抑制惡性克隆起保護

26、性作用；（2）Th17細胞可能選擇性殺傷惡性克隆，在一定程度上解除了惡性克隆對正常造血的抑制，保持了正常造血克隆的相對優(yōu)勢；
　?。?）染色體異常組Th17比例較染色體正常組顯著減低，且Th17細胞比例越低，染色體惡性度越高，進一步表明Th17細胞可直接或間接殺傷畸變的惡性克隆。（4）Th17細胞上游分子IL-6、IL-23水平異常可能是引起Th17細胞數(shù)量功能異常的罪魁禍首；
　　（5）Th17細胞可能通過IL-17/CT