CCL20應(yīng)答Th17細(xì)胞在IgA腎病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景:IgA腎病((ImmunoglobulinANephropathy,IgAN)通常在上呼吸道感染后發(fā)病或加重，但具體機(jī)制不明，溶血性鏈球菌（Hemolyticstreptococcus，HS）是其感染的主要病原菌之一，以甲型較常見(jiàn)。CD4+T細(xì)胞是參與腎小球腎炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要免疫細(xì)胞。作為輔助性T細(xì)胞的新亞群，Th17細(xì)胞參與了包括哮喘、腎炎等疾病的自身免疫性損傷的發(fā)病機(jī)制及疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，HS能夠誘導(dǎo)Th17

2、細(xì)胞的分化。而Th17細(xì)胞又通過(guò)循環(huán)而浸潤(rùn)至腎實(shí)質(zhì)，分泌IL-17等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等腎臟固有細(xì)胞的表面受體，使其釋放大量的趨化因子CXCL1、CCL2、CCL20等，其中CCL20通過(guò)與相應(yīng)的受體CCR6相結(jié)合，招募體內(nèi)中性粒細(xì)胞等最終觸發(fā)免疫介導(dǎo)的腎臟病理?yè)p傷過(guò)程?；谏鲜?，本研究推測(cè):上呼吸道感染誘發(fā)或加重IgAN過(guò)程中，HS有可能通過(guò)CCL20應(yīng)答Th17細(xì)胞效應(yīng)致腎小球炎癥損傷，因此，深入探

3、討CCL20應(yīng)答Th17細(xì)胞在IgA腎病發(fā)病機(jī)制中的作用有十分重要的臨床意義。
　　目的:本研究擬明確HS導(dǎo)致IgAN免疫炎癥損傷加重過(guò)程中CCL20對(duì)Th17細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)。具體如下:
　　方法:
　　(1)建立甲型HS感染IgAN小鼠模型并采用抗CCL20抗體對(duì)其進(jìn)行干預(yù):
　　采用脂多糖、四氯化碳、牛血清白蛋白聯(lián)合建立IgANBALB/c小鼠模型，在此基礎(chǔ)上，采用從IgAN扁桃體炎患者腭扁桃體中分離的甲型HS

4、感染IgAN小鼠建立HS感染IgAN模型。用CCL20抗體對(duì)IgAN小鼠模型進(jìn)行干預(yù);實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常對(duì)照組、IgAN組、HS感染IgAN組、抗CCL20抗體干預(yù)IgAN組、抗CCL20抗體干預(yù)HS感染IgAN組。
　　(2)標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測(cè)
　　干預(yù)完成后獲取小鼠尿液及肺、腎組織，對(duì)小鼠尿液行尿蛋白檢測(cè)及尿沉渣鏡檢;采用HE染色和PAS染色觀察小鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化，HE染色觀察肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，電鏡下觀察腎組織超微

5、結(jié)構(gòu)的改變，免疫熒光觀察腎組織IgA情況;分離各組小鼠一側(cè)腎組織中的淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)目和比率;ELISA檢測(cè)腎組織勻漿液中CCL20、IL-17A、IL-6及IL-21的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)小鼠血尿蛋白尿變化
　　對(duì)照組小鼠尿液檢查示血尿、蛋白尿均為陰性;IgAN小鼠均出現(xiàn)血尿、蛋白尿(P＜0.05);HS感染IgAN小鼠蛋白尿程度較IgAN組加重(P＜0.05）;抗C

6、CL20抗體干預(yù)后IgAN小鼠及HS感染IgAN小鼠蛋白尿程度明顯減輕(P＜0.05）。
　　(2)抗CCL20抗體對(duì)小鼠腎、肺組織形態(tài)學(xué)的影響形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示IgAN小鼠模型和HS感染IgAN小鼠模型構(gòu)建成功:與對(duì)照組小鼠相比，HE染色和PAS染色顯示IgAN小鼠出現(xiàn)系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生，而HS感染IgAN的上述病變進(jìn)一步加重，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生更明顯。與對(duì)照組小鼠相比，電鏡下IgAN小鼠腎組織可見(jiàn)系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度

7、增生，有電子致密物沉積，足突階段性融合;HS感染IgAN小鼠病變較IgAN小鼠進(jìn)一步加重:系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕中度增生，可見(jiàn)大量電子致密物沉積，足突廣泛融合，少數(shù)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大增生。免疫熒光顯示，與IgAN小鼠相比，HS感染IgAN小鼠腎組織中沉積于毛細(xì)血管壁及系膜區(qū)的IgA強(qiáng)度增強(qiáng)。而抗CCL20抗體干預(yù)則能夠改善IgAN小鼠及HS感染IgA腎病小鼠腎臟組織病變。
　　與對(duì)照組小鼠相比，HE染色提示HS感染能夠加據(jù)IgAN

8、小鼠的氣道炎癥和腎臟病變;而抗CCL20抗體干預(yù)則能夠減輕IgAN小鼠及HS感染IgAN小鼠氣道炎癥及腎組織病變。
　　(3)抗CCL20抗體對(duì)小鼠Th17細(xì)胞的影響
　　流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，IgAN小鼠腎臟Treg水平降低(P＜0.05），而Th17升高(P＜0.05），Th17/Treg比值升高(P＜0.05);HS感染使Treg水平進(jìn)一步降低，Th17和Th17/Treg比值進(jìn)一步升高(P＜0.05

9、);抗CCL20抗體干預(yù)能夠使IgAN小鼠及HS感染IgAN小鼠Th17水平下降(P＜0.05)，Treg無(wú)明顯變化，但Th17/Treg比值降低(P＜0.05)，免疫失衡有所改善（P＜0.05）。
　　ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IgAN小鼠腎組織勻漿液中CCL20、IL-17A、IL-6及IL-21明顯升高(P＜0.05)，與IgAN小鼠相比，HS感染IgAN小鼠后上述細(xì)胞因子顯著升高(P＜0.05)，而抗CCL20