miR-143抑制骨髓增生異常綜合征細胞增殖的作用機制.pdf

1、目的：通過檢測高危、轉(zhuǎn)白 MDS患者及 MDS細胞系 SKM-1 miR-143的表達水平，進而探討miR-143過表達對MDS細胞系SKM-1增殖的作用機制，并明確該細胞增殖調(diào)控的 miR-143的靶基因，進一步分析MDS的發(fā)病機制。
　　方法：收集33例高危及轉(zhuǎn)白MDS患者骨髓標(biāo)本為研究對象，其中RAEB-I7例，RAEB-II11例，sAML15例。以11例健康人的骨髓標(biāo)本為對照，所有骨髓標(biāo)本通過分離單個核細胞后與SKM-1

2、細胞分別提取總RNA，使用Quantitative real-time PCR技術(shù)檢測兩組骨髓標(biāo)本及SKM-1細胞中miR-143的相對表達水平。
　　構(gòu)建攜 miR-143的重組慢病毒載體 LV-hsa-mir-143（LV-hsa-mir-143）及其陰性對照空載體GV217并穩(wěn)定感染至MDS細胞株SKM-1中，通過流式細胞術(shù)檢測感染效率、qRT-PCR檢測SKM-1細胞中 miRNA-143的表達水平驗證感染成功率，CCK-

3、8法檢測上調(diào)miR-143的表達水平對SKM-1細胞增殖的影響，流式細胞術(shù)檢測上調(diào)miR-143表達水平后SKM-1細胞的凋亡率、細胞周期，Western blotting技術(shù)檢測miR-143靶基因ERK5在SKM-1細胞的表達水平，qRT-PCR、Western blotting檢測凋亡通路的激活。
　　構(gòu)建干擾 miR-143表達的重組慢病毒載體LV-hsa-mir-143-3p-inhibition（LV-hsa-mir-

4、143-3p-inhibition），將其感染至SKM-1細胞中并加入ERK5抑制劑檢測SKM-1細胞的凋亡率，驗證除ERK5外是否還有miR-143的其他靶基因作用于SKM-1。應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件TargetScan，miRanda和miRDBA預(yù)測miR-143的靶基因，構(gòu)建潛在靶基因AF9/MLLT33’UTR的野生型和突變型載體，分別與miR-143 mimics共轉(zhuǎn)染293T細胞，并使用雙熒光素酶報告基因驗證， Western

5、 blotting檢測AF9/MLLT3在SKM-1中的表達水平。
　　結(jié)果：高危及轉(zhuǎn)白MDS患者骨髓與SKM-1細胞中miR-143表達水平用2-ΔΔCT表示RAEB-I為0.636，RAEB-II為0.737，sAML為0.217以及 SKM-1的0.480，均顯著低于健康對照的2.30（ P＜0.05）。LV-hsa-mir-143及其陰性對照感染 SKM-1細胞的感染率超過60％， LV-hsa-mir-143感染組miR

6、-143的表達qRT-PCR檢測后用2-ΔΔCT，其表達值是陰性對照和未感染組的9.11倍。上調(diào) miR-143的表達抑制SKM-1細胞的增殖，其增殖情況用OD值表示， LV-hsa-mir-143感染組24 h，48 h，72 h OD值為0.242，0.299，0.339，低于陰性對照組0.338，0.624，0.803和 SKM-1細胞未感染組0.300，0.677，0.799（P＜0.05）。
　　上調(diào)miR-143的表達

7、水平誘導(dǎo)SKM-1的凋亡，其中LV-hsa-mir-143感染組凋亡率為48.4%，高于陰性對照組的14.6%和未感染組的16.3%。而對于細胞周期的阻滯，上調(diào) miR-143的表達 SKM-1細胞的 G1/G0期阻滯率分別比陰性對照和未感染組高18.3%和16.5%，與此同時，S期的阻滯率明顯低于陰性對照組和未感染組。在 SKM-1細胞中， miR-143的表達水平與其靶基因ERK5蛋白的表達水平呈負相關(guān)。上調(diào)miR-143表達水平后

8、FasL介導(dǎo)的凋亡通路被激活。
　　ERK5抑制劑劑量達到飽和的情況下，ERK5抑制劑組細胞的凋亡率高于miR-143表達干擾組，但仍明顯低于為感染SKM-1細胞株，提示可能有 miR-143的另一個靶基因存在。靶基因預(yù)測軟件預(yù)測AF9/MLLT3等多個基因可能為miR-143的靶基因，經(jīng)篩選AF9/MLLT3極有可能為miR-143的靶基因，雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示miR-143類似物能抑制野生型 AF9/MLLT3熒光素酶活