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文檔簡介
1、目的:通過檢測高危、轉白 MDS患者及 MDS細胞系 SKM-1 miR-143的表達水平,進而探討miR-143過表達對MDS細胞系SKM-1增殖的作用機制,并明確該細胞增殖調(diào)控的 miR-143的靶基因,進一步分析MDS的發(fā)病機制。
方法:收集33例高危及轉白MDS患者骨髓標本為研究對象,其中RAEB-I7例,RAEB-II11例,sAML15例。以11例健康人的骨髓標本為對照,所有骨髓標本通過分離單個核細胞后與SKM-1
2、細胞分別提取總RNA,使用Quantitative real-time PCR技術檢測兩組骨髓標本及SKM-1細胞中miR-143的相對表達水平。
構建攜 miR-143的重組慢病毒載體 LV-hsa-mir-143(LV-hsa-mir-143)及其陰性對照空載體GV217并穩(wěn)定感染至MDS細胞株SKM-1中,通過流式細胞術檢測感染效率、qRT-PCR檢測SKM-1細胞中 miRNA-143的表達水平驗證感染成功率,CCK-
3、8法檢測上調(diào)miR-143的表達水平對SKM-1細胞增殖的影響,流式細胞術檢測上調(diào)miR-143表達水平后SKM-1細胞的凋亡率、細胞周期,Western blotting技術檢測miR-143靶基因ERK5在SKM-1細胞的表達水平,qRT-PCR、Western blotting檢測凋亡通路的激活。
構建干擾 miR-143表達的重組慢病毒載體LV-hsa-mir-143-3p-inhibition(LV-hsa-mir-
4、143-3p-inhibition),將其感染至SKM-1細胞中并加入ERK5抑制劑檢測SKM-1細胞的凋亡率,驗證除ERK5外是否還有miR-143的其他靶基因作用于SKM-1。應用靶基因預測軟件TargetScan,miRanda和miRDBA預測miR-143的靶基因,構建潛在靶基因AF9/MLLT33’UTR的野生型和突變型載體,分別與miR-143 mimics共轉染293T細胞,并使用雙熒光素酶報告基因驗證, Western
5、 blotting檢測AF9/MLLT3在SKM-1中的表達水平。
結果:高危及轉白MDS患者骨髓與SKM-1細胞中miR-143表達水平用2-ΔΔCT表示RAEB-I為0.636,RAEB-II為0.737,sAML為0.217以及 SKM-1的0.480,均顯著低于健康對照的2.30( P<0.05)。LV-hsa-mir-143及其陰性對照感染 SKM-1細胞的感染率超過60%, LV-hsa-mir-143感染組miR
6、-143的表達qRT-PCR檢測后用2-ΔΔCT,其表達值是陰性對照和未感染組的9.11倍。上調(diào) miR-143的表達抑制SKM-1細胞的增殖,其增殖情況用OD值表示, LV-hsa-mir-143感染組24 h,48 h,72 h OD值為0.242,0.299,0.339,低于陰性對照組0.338,0.624,0.803和 SKM-1細胞未感染組0.300,0.677,0.799(P<0.05)。
上調(diào)miR-143的表達
7、水平誘導SKM-1的凋亡,其中LV-hsa-mir-143感染組凋亡率為48.4%,高于陰性對照組的14.6%和未感染組的16.3%。而對于細胞周期的阻滯,上調(diào) miR-143的表達 SKM-1細胞的 G1/G0期阻滯率分別比陰性對照和未感染組高18.3%和16.5%,與此同時,S期的阻滯率明顯低于陰性對照組和未感染組。在 SKM-1細胞中, miR-143的表達水平與其靶基因ERK5蛋白的表達水平呈負相關。上調(diào)miR-143表達水平后
8、FasL介導的凋亡通路被激活。
ERK5抑制劑劑量達到飽和的情況下,ERK5抑制劑組細胞的凋亡率高于miR-143表達干擾組,但仍明顯低于為感染SKM-1細胞株,提示可能有 miR-143的另一個靶基因存在。靶基因預測軟件預測AF9/MLLT3等多個基因可能為miR-143的靶基因,經(jīng)篩選AF9/MLLT3極有可能為miR-143的靶基因,雙熒光素酶報告基因結果顯示miR-143類似物能抑制野生型 AF9/MLLT3熒光素酶活
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