青蒿琥酯抗骨髓增生異常綜合征作用和機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨髓增生異常綜合癥(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組以骨髓無(wú)效造血和具有向AML轉(zhuǎn)化傾向?yàn)樘卣鞯漠愘|(zhì)性強(qiáng)的惡性克隆性疾病，發(fā)病以老年人多見，無(wú)法承受強(qiáng)烈化療和骨髓移植治療，治療相當(dāng)棘手而療效卻很有限。目前仍為不可治愈的惡性血液病。高危MDS治療效果差，多數(shù)患者不得不依賴輸血生存，并最終轉(zhuǎn)化為AML而死亡，預(yù)后極差。因此有必要尋找效果好骨髓抑制輕且經(jīng)濟(jì)的新藥物來(lái)改善中高危MDS患者的預(yù)后。
　　

2、青蒿琥酯(artesunate，ART)是自中藥青蒿中提取的青蒿素的半合成衍生物。是一種安全有效的抗瘧藥。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其通過(guò)促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞分化和程序性死亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖來(lái)抑制腫瘤。低濃度對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒作用，高濃度時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有胚胎毒性、可逆性腎損傷和骨發(fā)育異常。高危MDS的特點(diǎn)是骨髓細(xì)胞高度增生，但存在無(wú)效造血而導(dǎo)致外周血三系減少，MDS的骨髓基質(zhì)細(xì)胞異常導(dǎo)致化療和移植后恢復(fù)慢，風(fēng)險(xiǎn)高。不能施行移植的高危MDS患者的治療

3、更需要尋找一種經(jīng)濟(jì)而安全有效的藥物，以改善患者的生存質(zhì)量。近幾年FDA批準(zhǔn)的用于MDS治療的去甲基化藥物5-氮雜胞苷(5-aza-cytidine，Aza)和5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycitidine，DAC)，一方面由于非靶向的細(xì)胞毒作用、潛在的致癌性、臨床應(yīng)用后耐藥病例的出現(xiàn)以及昂貴的治療費(fèi)用，另一方面雖然改善輸血依賴有效率達(dá)50％，但是較低的總反應(yīng)率(10％-20％)，限制了其在MDS的治療應(yīng)用。青蒿琥

4、酯多年來(lái)用于抗瘧治療安全而有效，不良反應(yīng)輕微，未見引起骨髓抑制的報(bào)道。青蒿琥酯對(duì)高危MDS細(xì)胞是否有治療作用，目前國(guó)內(nèi)外也未見相關(guān)研究。因此我們以高危MDS細(xì)胞系SKM-1細(xì)胞和原代MDS細(xì)胞為研究對(duì)象。觀察ART能否誘導(dǎo)高危MDS細(xì)胞的凋亡，并探索凋亡的分子機(jī)制。
　　近來(lái)臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示表觀遺傳學(xué)異常在MDS發(fā)病和向白血病轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，是臨床治療MDS很具前景的靶位。發(fā)揮異常甲基化狀態(tài)維持作用的DNMT1在AML和

5、MDS中轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常[26]，同時(shí)也是備受關(guān)注的表觀遺傳學(xué)治療靶位。鑒于表觀遺傳學(xué)變化在MDS發(fā)生發(fā)展中的重要作用，在前期研究基礎(chǔ)上從表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)基因的角度來(lái)探討ART作用于MDS細(xì)胞的機(jī)制，為ART用于高危MDS的治療提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1 CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ART處理后SKM-1細(xì)胞的活力，設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照、Trolox預(yù)處理組及Ac-DEVD-CHO預(yù)處理組。檢測(cè)正常對(duì)照骨髓單個(gè)核

6、細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、高危MDS患者的原代細(xì)胞和MDS轉(zhuǎn)化的AML患者的原代細(xì)胞經(jīng)ART處理前后的活力變化。DAC與ART聯(lián)用的細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，聯(lián)用效應(yīng)應(yīng)用聯(lián)用指數(shù)(CI)來(lái)評(píng)價(jià)。
　　2瑞氏-吉姆薩染色觀察10μmol/L的ART處理24h后的SKM-1細(xì)胞和MDS原代幼稚細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　3 PI染色檢測(cè)ART處理SKM-1細(xì)胞24h后細(xì)胞周期的變化和亞二倍體峰的有無(wú)。
　　4 JC-1陽(yáng)離子脂質(zhì)

7、熒光染料染色檢測(cè)用終濃度分別為1、5、10μmol/L的ART處理1h后的SKM-1細(xì)胞MMP變化，和10μmol/L的ART處理0.5、1、3、6、12、24h后的SKM-1細(xì)胞MMP變化。
　　5蛋白印跡(WB)檢測(cè)終濃度為1、5、10μmol/L的ART處理SKM-1細(xì)胞6h后caspase-8、caspase-9、活性的caspase3、PARP、bid、AIF的表達(dá)。檢測(cè)凋亡調(diào)節(jié)蛋白BCL-2、bax、bad、P-bad

8、、survivin、XIAP。檢測(cè)SKM-1細(xì)胞生存通路P13K/AKT主要信號(hào)蛋白Pten、Akt、P-Akt(Ser473)和P-Akt(Thr308)的變化。第二部分研究中，收集1、5、10μmol/L的ART作用6h后和10μmol/L的ART處理3h、6h、12h后的SKM-1細(xì)胞，以未加ART組作空白對(duì)照，檢測(cè)DNMT1蛋白水平的變化。
　　6 Fluo-3-Am熒光探針檢測(cè)10μmol/L的ART處理0.5、1、3h

9、后的SKM-1細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度的變化。
　　7 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)10μmol/L的ART處理0.5、3、6、12、24h后的SKM-1細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的變化。
　　8細(xì)胞免疫熒光染色觀察SKM-1細(xì)胞在10μmol/L的ART處理6h后是否存在AIF核內(nèi)轉(zhuǎn)位。
　　9 RT-PCR檢測(cè)DNMT1 mRNA變化。分組收集1、5、10μmol/L的ART作用6h后和10μmol/L的ART處理3h、6h、12h后

10、的SKM-1細(xì)胞，以PBS代ART組作溶劑對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。
　　10熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)分析ART處理前后p15INK4BmRNA變化，實(shí)驗(yàn)分組收集1、5、10μmol/L的ART作用12h后的SKM-1細(xì)胞，以PBS代ART組作溶劑對(duì)照，以80μmol/L的DAC為陽(yáng)性對(duì)照。
　　11甲基化特異性PCR檢測(cè)p15INK4B的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的變化。實(shí)驗(yàn)分組為未處理的SKM-1細(xì)胞、10μmol/L的ART處理12h后

11、的SKM-1細(xì)胞、80μmol/L的DAC處理12h的SKM-1細(xì)胞。
　　12 Annexin V/PI染色標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)DAC和ART聯(lián)用組與單用組細(xì)胞凋亡率的差別。
　　結(jié)果：
　　1 ART對(duì)MDS細(xì)胞系生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。24h、48h和72h的IC50分別為15.41μmol/L、3.43μmol/L和1.92μmol/L。以終濃度為1、5、10μmol/L的ART處理MDS原代細(xì)胞48h，細(xì)胞生

12、長(zhǎng)呈不同程度的抑制，三例病人原代細(xì)胞的48h的IC50分別為36.05μmol/L、118μmol/L、34.72μmol/L。以終濃度為1、5、10、100、200μmol/L的ART處理正常對(duì)照骨髓單個(gè)核細(xì)胞48h，細(xì)胞生長(zhǎng)呈輕度抑制。48h的IC50均>190μmol/L，分別為195.14μmol/L，531.88μmol/L，1683.96μmol/L。以終濃度為1、5、10、100、200μmol/L的ART處理正常對(duì)照骨髓

13、基質(zhì)細(xì)胞僅輕度抑制其活力，而3例病人(MDS或MDS-AML)的48h的IC50均>150μmol/L，分別為227.026μmol/L，154.03μmol/L，212.49μmol/L。抗氧化劑Trolox預(yù)處理減輕ART對(duì)SKM-1細(xì)胞的抑制，caspase3、7抑制劑Ac-DEVD-CHO部分減少ART對(duì)SKM-1細(xì)胞的抑制。
　　2瑞氏-吉姆薩染色顯示ART作用于MDS細(xì)胞后可見凋亡小體、核碎裂等凋亡表現(xiàn)。
　　3

14、經(jīng)終濃度為1、5、10μmol/L的ART處理SKM-1細(xì)胞24h后，SKM-1細(xì)胞的周期阻滯于G0/G1期并伴亞二倍體峰出現(xiàn)，且亞二倍體呈劑量依賴性增加(p<0.005)
　　4經(jīng)1、5、10μmol/L的ART處理SKM-1細(xì)胞6h后，ART可誘導(dǎo)AIF轉(zhuǎn)位入核(p<0.005)，呈劑量依賴性正相關(guān)，pearson相關(guān)性系數(shù)=0.740，P=0.003；高劑量時(shí)經(jīng)內(nèi)源通路激活csapase-9(p<0.05)，進(jìn)而激活casp

15、ase-3(p<0.005)、切割PARP而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，casepase-9水平與ART劑量呈低度負(fù)相關(guān)(pearson相關(guān)性系數(shù)=-0.656，P=0.010)，激活的casepase-3與ART劑量呈低度正相關(guān)(pearson相關(guān)性系數(shù)=0.553，P=0.031)；切割的PARP與ART劑量呈低度正相關(guān)(pearson相關(guān)性系數(shù)=0.614，P=0.017)。終濃度為1、5、10μmol/L的ART處理SKM-1細(xì)胞12h未見c

16、aspase8和Bid有明顯變化(p>0.05)。對(duì)SKM-1細(xì)胞在10μmol/L的ART處理6h前后進(jìn)行間接免疫熒光染色，AIF的核內(nèi)轉(zhuǎn)位可應(yīng)用敏感的激光共聚焦顯微鏡觀察到。
　　5經(jīng)終濃度為1、5、10μmol/L的ART處理SKM-1細(xì)胞1h后線粒體膜電位(MMP)與ART呈劑量依賴性下降，單因素方差分析，F(xiàn)=230.12，P<0.005；10μmol/L的ART處理0.5、1、3、6、12、24h后的SKM-1細(xì)胞MMP

17、呈時(shí)間依賴性下降，Dunnett T3分析，P<0.05，pearson相關(guān)性分析，r=0.702，P=0.011。
　　6細(xì)胞內(nèi)鈣離子在10μmol/L的ART處理后的0.5h即已經(jīng)上升，持續(xù)至6h仍較對(duì)照組高，單因素方差分析F=274.848，P<0.005；細(xì)胞內(nèi)活性氧簇在10μmol/L的ART處理后的6h開始上升，持續(xù)至12h仍較對(duì)照組高，單因素方差分析F=255.266，P<0.005；0.5h、3h和24h與處理前無(wú)

18、明顯差異P>0.05。
　　7經(jīng)1、5、10μmol/L的ART處理SKM-1細(xì)胞6h行總蛋白WB檢測(cè)結(jié)果顯示：Bad蛋白表達(dá)在ART處理后呈上升趨勢(shì)，但與對(duì)照相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=0.598，P=0.639；P-Bad蛋白表達(dá)在ART處理后呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異具顯著性，F(xiàn)=22.034，P<0.005，與ART劑量呈高度負(fù)相關(guān)性：pearson相關(guān)系數(shù)=0.909，P<0.005。BCl-2/Bax比值呈下降趨勢(shì)并呈劑量

19、依賴性(control Vs1μmol/L ART Vs5μmol/L ART Vs10μmol/L ART，1.775±0.24 Vs1.2033±0.01 Vs1.1743±0.26Vs0.833±0.02)，單因素方差分析F=14.23，P<0.005；相關(guān)分析顯示pearson相關(guān)系數(shù)=-0.866，P<0.005。XIAP蛋白表達(dá)在ART處理后呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照相比差異無(wú)顯著性；Survivin蛋白表達(dá)在ART處理后呈下降趨勢(shì)

20、，與對(duì)照相比差異有顯著性，F(xiàn)=19.172，P=0.001，和ART劑量呈高度負(fù)相關(guān)，pearson相關(guān)系數(shù)=-0.849，P<0.005。
　　8經(jīng)終濃度為1、5、10μmol/L的ART處理SKM-1細(xì)胞6h后Pten呈上升趨勢(shì)，單因素方差分析：F=10.003，p=0.004，呈劑量依賴性，pearson相關(guān)系數(shù)=0.873，P<0.005；P-Akt(Ser473)呈下降趨勢(shì)，單因素方差分析：F=14.836，p=0.00

21、1，呈劑量依賴性，pearson相關(guān)系數(shù)=-0.854，P<0.005；p-Akt(Thr308)呈下降趨勢(shì)，單因素方差分析：F=5.851，p=0.021，呈劑量依賴性，pearson相關(guān)系數(shù)=-0.539，p>0.05；在10μmol/L的ART處理后Akt呈有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降，單因素方差分析：F=8.177，p=0.008，但劑量依賴性不明顯，pearson相關(guān)系數(shù)=0.210，p=0.513如Fig.12所示。
　　9 A

22、RT處理SKM-1細(xì)胞后DNMT1基因表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性下降
　　10 ART處理SKM-1細(xì)胞后DNMT1蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性下降，劑量依賴下降不明顯
　　11 ART處理SKM-1細(xì)胞后DNMT1蛋白靶基因p15INK4B表達(dá)呈劑量依賴性上升，ART處理SKM-1細(xì)胞后DNMT1蛋白靶基因p15INK4B啟動(dòng)子甲基化程度下降，非甲基化啟動(dòng)子較ART處理前明顯上升
　　12 ART聯(lián)合DAC對(duì)SKM-1細(xì)胞凋亡誘

23、導(dǎo)作用呈正協(xié)同，高于各自單藥的作用。5μmol/L的ART與受試濃度范圍(1-1600μmol/L)的DAC均有正協(xié)同作用(CI=0.63、0.5、0.28、0.46、0.19，P<0.005)。Ac-DEVD-CHO預(yù)處理不能抑制ART對(duì)DAC的凋亡誘導(dǎo)增強(qiáng)作用(P<0.005)。
　　結(jié)論：
　　1 ART體外對(duì)高危MDS細(xì)胞系SKM-1和高危MDS原代細(xì)胞的細(xì)胞活力有明顯抑制作用；對(duì)非血液病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓單個(gè)核

24、細(xì)胞的活力有輕度抑制作用。
　　2 ART可在體外誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，主要阻滯在G0/G1期，并伴有劑量依賴性出現(xiàn)的亞二倍體峰。
　　3 ART在體外可誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞和高危MDS原代細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　4 ART對(duì)SKM-1細(xì)胞的損傷的早期事件是細(xì)胞內(nèi)鈣離子上升而后線粒體膜電位下降，接下來(lái)細(xì)胞內(nèi)ROS的上升使得損傷持續(xù)和加重。
　　5 ART對(duì)SKM-1細(xì)胞的抑制作用是以凋亡誘導(dǎo)為主，該種凋亡

25、是通過(guò)內(nèi)源性凋亡誘導(dǎo)途徑啟動(dòng)的，經(jīng)caspase依賴和非依賴途徑進(jìn)行的。
　　6 BCL-2家族中BCl-2/bax比值下降、bad磷酸化水平的下降、IAP家族中survivin的下降是AWT誘導(dǎo)凋亡作用在凋亡相關(guān)分子層面的作用機(jī)制之一。
　　7 PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控是ART誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。
　　8 ART通過(guò)抑制DNMT1 mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)來(lái)恢復(fù)SKM-1細(xì)胞中