青蒿琥酯、PEDF、K5抑制血管增生的作用及機(jī)制研究.pdf

1、主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 第一部分青蒿琥酯抑制角膜血管新生的作用及機(jī)制研究
　　 1.青蒿琥酯抑制堿燒傷大鼠角膜血管新生的作用
　　 構(gòu)建大鼠堿燒傷角膜新生血管模型，于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量各處理組角膜堿燒傷后角膜最長(zhǎng)新生血管長(zhǎng)度，計(jì)算角膜新生血管面積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組面積為29.30mm2±2.588mm2,0.1％地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組面積為8.97mm2±1.576mm2,25μmol/L青蒿琥酯處理組面積為

2、22.02mm2±6.378mm2；青蒿琥酯組和地塞米松組角膜炎癥指數(shù)明顯低于陰性對(duì)照組；堿燒傷24小時(shí)后對(duì)角膜缺損面積測(cè)量顯示，陰性對(duì)照組缺損面積為6.82mm2±1.647mm2,0.1％地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組為5.32mm2±1.141mm2,青蒿琥酯組為4.73mm2±0.917mm2。說(shuō)明青蒿琥酯具有抑制堿燒傷角膜血管新生和角膜炎癥反應(yīng)的作用(P<0.01)，對(duì)損傷早期角膜上皮的愈合無(wú)影響(P>0.05)。
　　 2.青蒿

3、琥酯選擇性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)的增殖
　　 (1)青蒿琥酯劑量依賴(lài)性抑制HUVECs增殖
　　 MTT增殖實(shí)驗(yàn)分析青蒿琥酯對(duì)HUVECs增殖的作用。結(jié)果顯示，同對(duì)照組相比，青蒿琥酯在6.25μmol/L～100μmol/L的濃度范圍內(nèi)劑量依賴(lài)性抑制HUVECs的增殖(P<0.01)。IC50約為25μmol/L。
　　 (

4、2)青蒿琥酯對(duì)正常人視網(wǎng)膜細(xì)胞muller細(xì)胞、正常肝細(xì)胞株chang liver cell和原代培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞(rabbit corneal epithelial cells，RCEpiCs)增殖的作用
　　 MTT增殖實(shí)驗(yàn)分析青蒿琥酯對(duì)muller細(xì)胞、正常肝細(xì)胞、和RCEpiCs增殖的作用。同對(duì)照組相比，25μmol/L青蒿琥酯處理后，正常肝細(xì)胞和muller細(xì)胞存活率分別為108.11％±5.799％與76.40％

5、±12.214％；50μmol/L青蒿琥酯處理后RCEpiCs細(xì)胞存活率為102.78％±1.013％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異沒(méi)有顯著性，說(shuō)明在低劑量下青蒿琥酯選擇性抑制HUVEC增殖。
　　 3.青蒿琥酯劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)HUVECs凋亡
　　 Annexin V-PI法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析青蒿琥酯對(duì)HUVECs的凋亡作用。結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組細(xì)胞自然凋亡率為5.33％±0.612％，25μmol/L秋水仙素陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)

6、胞凋亡率為38.98％±1.590％，而12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L青蒿琥酯處理組的凋亡率分別為10.88％±1.036％、21.7％±0.936％、34.48％±1.216％、47.41％±1.180％。說(shuō)明青蒿琥酯呈劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(P<0.01)。
　　 4.青蒿琥酯通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡通路誘導(dǎo)HUVECs凋亡
　　 DiOC2(3)熒光染料分析線(xiàn)粒體膜電位。

7、結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，CCCP組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為對(duì)照組細(xì)胞的43.64％±2.29％，25μmol/L和100μmol/L青蒿琥酯處理24h后，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組的63.20％±5.97％和37.07％±4.35％，說(shuō)明青蒿琥酯呈劑量依賴(lài)性導(dǎo)致HUVECs線(xiàn)粒體膜電位降低。Western blotting分析顯示，100μmol/L青蒿琥酯處理HUVECs24h后，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-

8、2比值升高；青蒿琥酯劑量依賴(lài)性促進(jìn)caspase9和caspase3的切割；100μmol/L青蒿琥酯處理HUVECs16h后細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C水平增多。
　　 5.青蒿琥酯通過(guò)鐵依賴(lài)性ROS-p38 MAPK通路誘導(dǎo)HUVECs凋亡
　　 (1)青蒿琥酯劑量與時(shí)間依賴(lài)性特異提高HUVECs中氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)水平
　　 Carboxy-H2DCFDA和Dihydro

9、ethidium(DHE)熒光探針?lè)謩e檢測(cè)HUVECs和RCEpiCs中ROS的變化。Carboxy-H2DCFDA檢測(cè)H2O2為主的自由基，DHE檢測(cè)O2-為主自由基。HUVECs中H2O2在25μmol/L青蒿琥酯處理后10min開(kāi)始升高，4h達(dá)高峰，隨后逐漸回落。Oμmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L青蒿琥酯分別處理HUVECs2h后，細(xì)胞內(nèi)H2O2為主的

10、ROS水平呈劑量依賴(lài)性提高(P<0.01)，但相同條件下對(duì)O2-為主的ROS水平僅微弱升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異沒(méi)有顯著性(P>0.05)。說(shuō)明，在HUVECs中青蒿琥酯產(chǎn)生以H2O2為主的ROS。25μmol/L和100μmol/L青蒿琥酯分別處理RCEpiCs細(xì)胞4h，細(xì)胞H2O2水平?jīng)]有變化。說(shuō)明青蒿琥酯特異地提高HUVECs中ROS水平。
　　 (2)青蒿琥酯產(chǎn)生的ROS是鐵離子依賴(lài)性的
　　 第二部分 PEDF抑制視

11、網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)作用及機(jī)制研究
　　 1.重組人色素上皮衍生因子(PEDF)的表達(dá)純化
　　 將pET30a/PEDF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)宿主菌，IPTG25℃低溫誘導(dǎo)14h～16h，提取細(xì)菌的裂解產(chǎn)物的可溶部分，Ni2+-His Bind Resin親和柱純化含有6個(gè)His-tag的重組PEDF蛋白，獲得高純度可溶性蛋白。凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描分析顯示純化后重組蛋白純度可達(dá)95％。純化

12、蛋白用自制兔抗人PEDF抗體進(jìn)行Western blotting分析鑒定，得到分子量約為50kD的雜交帶。
　　 2.PEDF抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)
　　 與PBS對(duì)照組相比，PEDF處理組腫瘤生長(zhǎng)較慢，在第1次給藥后35天處死裸鼠，剝瘤、稱(chēng)重。對(duì)照組與PEDF處理組鼠重均在23g～26g，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)明顯差異(P>0.05)；計(jì)算和比較各組瘤均重，結(jié)果顯示：總劑量為12mg/kg的PEDF對(duì)BALB/c裸鼠視網(wǎng)

13、膜母細(xì)胞瘤(SO-Rb50)生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用(P<0.01)，抑瘤率為68.78％。
　　 3.PEDF特異性抑制HUVECs增殖
　　 MTT增殖實(shí)驗(yàn)分析PEDF對(duì)HUVECs和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SO-Rb50的增殖作用。結(jié)果顯示，同對(duì)照組相比，PEDF在10nmol/L～320nmol/L的濃度范圍內(nèi)劑量依賴(lài)性抑制HUVEC的增殖(P<0.01)。IC50約為80nmol/L。相同劑量PEDF對(duì)SO-Rb50

14、細(xì)胞沒(méi)有增殖抑制作用(P>0.05)。
　　 4.PEDF特異性誘導(dǎo)HUVECs凋亡
　　 Annexin V-PI法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析PEDF對(duì)HUVECs和SO-Rb50的凋亡作用。結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組HUVECs和SO-Rb50凋亡率分別為6.47％±0.48％和3.3％±0.3％，25μmol/L的秋水仙素陽(yáng)性對(duì)照組兩種細(xì)胞的凋亡率分別為26.05％±2.32％和14.1％±0.4％，200nmol/

15、LPEDF處理組HUVECs和SO-Rb50細(xì)胞凋亡率分別為17.18％±2.74％和2.5％±0.04％。說(shuō)明PEDF僅促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(P<0.01)，對(duì)SO-Rb50細(xì)胞沒(méi)有凋亡誘導(dǎo)作用(P>0.05)。
　　 5.PEDF在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤向神經(jīng)元分化
　　 從細(xì)胞形態(tài)以及應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析PEDF對(duì)SO-Rb50細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的影響。結(jié)果顯示，藥物處理SO-Rb5014天后，1nm

16、ol/L的PEDF處理組細(xì)胞呈梭形，出現(xiàn)突起；處理17天后組細(xì)胞突起明顯較前變粗變長(zhǎng)；而對(duì)照組沒(méi)有上述變化。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，藥物處理SO-Rb5017天后，PEDF處理組細(xì)胞漿體積明顯變大，可見(jiàn)核周、胞漿及突起內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)志分子神經(jīng)元烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)和神經(jīng)纖維微絲蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組兩種蛋白表達(dá)較弱或無(wú)表達(dá)。說(shuō)明PEDF能誘導(dǎo)SO-Rb50細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
　　 7.

17、PEDF下調(diào)腫瘤中VEGF表達(dá)。
　　 第三部分 K5抑制肝癌腫瘤生長(zhǎng)作用的研究
　　 1.K5特異性抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillaryendothelial cells，HRCECs)的生長(zhǎng)。
　　 K5劑量依賴(lài)性地抑制HRCECs的增殖，IC50為160nmol/L，而對(duì)人視網(wǎng)膜周皮細(xì)胞(human retinal pericyte cells，HRPCs)的增殖無(wú)明顯

18、影響。K5處理HRCECs組的細(xì)胞凋亡率顯著地高于PBS對(duì)照組(P<0.01)，表明K5具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。K5對(duì)正常肝細(xì)胞(chang liver cell)和肝癌細(xì)胞(HepA，Bel-7402)的增殖和凋亡無(wú)明顯作用，說(shuō)明K5具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞的高度特異性。
　　 2.K5抑制肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用。
　　 腹腔注射K5總劑量為7.5mg/kg，對(duì)昆明小鼠(KM小鼠)肝癌(HepA)實(shí)體瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作