基于青蒿琥酯抗菌增敏作用的新型AcrB抑制劑的設計、合成及作用研究.pdf

1、目的：在抗生素的選擇壓力下,細菌幾乎對所有臨床使用的抗生素都產生耐藥性。20世紀70年代后,細菌多藥耐藥性(MDR)逐年增加，如何應對耐藥菌感染已成為嚴峻問題。2013年中國主要地區(qū)醫(yī)院收集的臨床分離菌中，革蘭陽性菌占27％，革蘭陰性菌占73%，其中大腸埃希菌、克雷伯菌屬和奇異變形桿菌中產 ESBLs菌株的檢出率分別為54.0%、31.8%和16.5%。由此可見，大腸埃希菌在醫(yī)院臨床檢出的耐藥病原菌中處于首位。因此，尋找新型抗菌藥物或提

2、高現(xiàn)有抗生素作用的藥物（抗菌增敏劑）、研究其作用機理具有著重要意義。
　　本課題組前期一直致力于在抗菌增敏劑的研究。最先發(fā)現(xiàn)，青蒿素的重要衍生物之一青蒿琥酯（AS）本身沒有抗菌活性，但是它具有增敏β-內酰胺類抗生素抗大腸埃希菌的活性（抗菌增敏活性），同時對AS的分子作用機制進行了探討。發(fā)現(xiàn)，AS通過抑制大腸埃希菌多藥耐藥 AcrAB-TolC系統(tǒng)中的轉運蛋白 AcrB發(fā)揮阻止抗生素外排，從而增加抗生素在菌體內的聚集而發(fā)揮抗菌作用。

3、
　　雖然 AS對臨床菌株的活性并不理想，但是青蒿素其他重要衍生物均不具備和 AS一樣的抗菌增敏活性?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，再通過它們的結構比較發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物有著共同的母核結構，差別僅僅在于支鏈的不同。因此，推測在母核結構相同的情況下，其支鏈結構是整個分子有無抗菌增敏活性的關鍵。為此，采用計算機分子模擬對接技術，在明確青蒿琥酯的支鏈結構對抗菌增敏活性至關重要的工作基礎上，對其支鏈結構進行改造，獲得了一系列新的青蒿素衍生物；在化學合

4、成上述衍生物后，并對其活性進行研究，其中命名為DHA7的化合物具有較AS更佳的抗菌增敏活性，其作用機制與AS相似，即也是通過抑制AcrB而發(fā)揮作用。但是，雖然DHA7的活性研究結果證實了對青蒿素支鏈和活性關系的推測，但遺憾的是DHA7同樣對臨床菌株活性較差，而且溶解性也較差，極大影響了其成藥性。為此擬繼續(xù)改造青蒿素支鏈結構，以期望獲得活性更為良好能夠應用于臨床的新型青蒿素衍生物。
　　因此，在本研究中擬繼續(xù)以AcrB為靶點，在前期

5、實驗基礎上利用構效關系分析和分子對接方法模擬靶蛋白與青蒿素及其衍生物相互作用；并以此為依據(jù)，在青蒿素結構的基礎上繼續(xù)進行結構改造；采用化學方法合成新型青蒿素衍生物并對其活性進行研究。
　　方法：
　　1.采用計算機輔助設計方法對前期18個化合物進行構效關系的研究，以此判斷青蒿素衍生物的化學活性結構及確立青蒿素衍生物分子的設計原則；
　　2.分子對接的方法模擬青蒿琥酯和DHA7與大腸埃希菌多藥外排泵轉運子AcrB的結合，

6、以此為依據(jù)確立青蒿素衍生物分子的篩選原則；
　　3.采用化學合成方法合成青蒿素衍生物4個；
　　4.采用棋盤二倍微孔稀釋法對新型青蒿素衍生物增強β-內酰胺類抗生素氨芐西林對大腸埃希菌ATCC35218的體外抗菌作用進行初篩；
　　5.采用動態(tài)生長曲線法和涂布平板法觀察具有較強抗菌增敏作用的新型青蒿素衍生物DHA27增強氨芐西林對大腸埃希菌ATCC35218生長的抑制作用；
　　6.采用化學方法將DHA27制備為鹽

7、酸鹽以增加化合物的水溶性；
　　7.采用棋盤二倍微孔稀釋法考察DHA27鹽酸鹽聯(lián)合β-內酰胺類抗生素氨芐西林對大腸埃希菌臨床株的抗菌增敏活性；
　　8.采用棋盤二倍微孔稀釋法考察DHA27鹽酸鹽聯(lián)合不同種類的抗生素對大腸埃希菌臨床株的抗菌增敏活性；
　　9.采用MTS法考察DHA27鹽酸鹽對細胞增殖的影響；
　　10.采用柔紅霉素和尼羅紅實驗觀察 DHA27鹽酸鹽對藥物在大腸埃希菌菌體內聚集的影響；
　　1

8、1.采用Realtime PCR檢測DHA27鹽酸鹽聯(lián)合氨芐西林對大腸埃希菌臨床株抗菌增敏活性與多藥外排泵轉運子AcrB表達量的關系；
　　12.采用Realtime PCR檢測DHA27鹽酸鹽對大腸埃希菌ATCC35218多藥外排泵轉運子AcrB表達的影響；
　　13.采用棋盤二倍微孔稀釋法觀察 DHA27鹽酸鹽對大腸埃希菌 AcrB敲除株和AcrB回補株的抗菌增敏活性；
　　14.分子對接的方法模擬DHA27與大腸

9、埃希菌多藥外排泵轉運子AcrB的結合，預測其對接位點；
　　15.采用柔紅霉素實驗觀察 DHA27結合多肽后對柔紅霉素在大腸埃希菌菌體內聚集的影響。
　　結果：
　　1.構效關系研究結果表明，青蒿素支鏈的空間和電子效應對該化合物的抗菌增敏活具有重要影響；依據(jù)此構效關系結果，以青蒿素母核結構為基礎結構，設計了一系列的新型青蒿素衍生物。
　　2.分子對接結果顯示，AS、DHA7與AcrB分子主要通過氫鍵結合。對比兩個

10、分子的對接結果，發(fā)現(xiàn) AS、DHA7的母核結合空腔位置幾乎相同，只是支鏈伸展到不同的方向。因此，推測青蒿素的支鏈部分對其與 AcrB活性中心的結合具有重要作用：阻止藥物分子結合到活性中心，阻隔活性中心附近的藥物通道，從而切斷藥物的運輸。其中，AcrB分子中的Gln176、Tyr327、Phe136可以通過氫鍵連接來固定這三個分子的骨架結構。
　　3.基于分子對接結果進行新的青蒿素衍生物結構的篩選，以AS、DHA7的青蒿素母核所在對

11、接空腔設為“模板”，將新的青蒿素衍生物進行分子對接，將對接在“模板”內的化合物設定為候選化合物，共得到22個候選化合物。
　　4.對22個候選化合物中分子對接評價較高的4個化合物進行化學合成，以滿足生物學活性評價的要求。
　　5.對4個化合物進行體外抗菌增敏活性的評價，結果顯示DHA27具有較強的抗菌增敏活性。
　　6. DHA27的合成鹽酸鹽解決其溶解性問題。
　　7.對DHA27體外抗菌增敏活性的深入研究結果

12、表明，DHA27聯(lián)合氨芐西林對大腸埃希菌臨床株的抗菌增敏作用總有效率達到78%（31/40）；DHA27聯(lián)合其他β-內酰胺類抗生素對大腸埃希菌臨床株也有良好活性，但聯(lián)合非β-內酰胺類抗生素時其活性較差。
　　8.對DHA27體外抗菌增敏活性的分子機制研究發(fā)現(xiàn)，DHA27抗菌增敏活性與AcrB的表達量呈正相關，DHA27增加抗生素在菌體內的聚集，其機制與下調大腸埃希菌AcrB的表達有關；
　　9. DHA27的抗菌增敏活性與A

13、crB密切相關：在AcrB敲除菌株DHA27的抗菌增敏活性消失，但在AcrB回補菌株其抗菌增敏活性恢復；
　　10.采用分子對接技術對其作用靶點的研究表明，DHA27與AcrB分子通過氫鍵結合，他們的結合位點為Ser46、Ser134；
　　11.柔紅霉素聚集實驗表明，DHA27與含有Ser46、Ser134的多肽片段有結合作用，當Ser46、Ser134發(fā)生突變后其結合作用消失。
　　12. MTS實驗結果顯示，DH

14、A27對RAW264.7細胞增殖無明顯影響。
　　結論：
　　1.以大腸埃希菌多藥外排泵轉運子 AcrB為靶點，進行 AS、DHA7構效關系和分子對接實驗，設計了22個候選化合物。
　　2.選取22個候選化合物中分子對接評價較高的4個化合物進行化學合成制備，經體外活性研究得到具有較高生物學活性的新的青蒿素衍生物DHA27。
　　3. DHA27聯(lián)合β-內酰胺類抗生素對大腸埃希菌標準菌株和臨床菌株均有良好的抗菌增敏