青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受小鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　膿毒癥(sepsis)是由感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicInflammatory response syndrome，SIRS)，膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致的膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是臨床危重患者死亡的主要原因，病死率高達(dá)30％～70％。
　　膿毒癥的病理生理表現(xiàn)為炎癥風(fēng)暴(cytokine storm)和

2、免疫抑制(immunosuppression)兩個(gè)階段。長(zhǎng)期以來(lái)，炎癥風(fēng)暴一直被認(rèn)為是膿毒癥的主要特征，因此將膿毒癥的研究焦點(diǎn)放在炎癥風(fēng)暴及其造成的MODS，并以此研究膿毒癥的防治措施，但是多種以抗炎為目的的治療策略卻均以失敗告終。近年來(lái)，來(lái)自臨床的報(bào)告顯示，雖然膿毒癥患者能度過(guò)前期的炎癥風(fēng)暴階段，但是許多卻因后期的繼發(fā)性感染和MODS而死亡，而這與患者處在免疫抑制階段、機(jī)體對(duì)病原微生物的二次打擊(second hit)抵抗力降低密切相

3、關(guān)。單核/吞噬細(xì)胞是機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線(xiàn)，在識(shí)別、清除病原微生物以及抗原的處理、提呈中發(fā)揮重要作用。其功能抑制與機(jī)體對(duì)二次打擊抵抗力的降低密切相關(guān)。
　　細(xì)菌內(nèi)毒素/脂多糖(endotoxin/lipopolysaccharide，LPS)是誘導(dǎo)膿毒癥的主要病原分子。內(nèi)毒素耐受將導(dǎo)致機(jī)體的過(guò)度免疫抑制，使機(jī)體更易遭受病原微生物的再次攻擊。通過(guò)建立內(nèi)毒素耐受模型可模擬臨床膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài)，為尋找治療膿毒癥有效藥物發(fā)揮

4、重要作用。
　　抗瘧藥青蒿琥酯(Artesunate，AS)是含有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素衍生物，具有水溶性好、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯具有顯著的抗炎作用，基于其抗炎作用我們發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)LPS攻擊小鼠、熱滅活大腸埃希菌(Escherichiacoli，EC)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)攻擊小鼠、大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistan

5、t Staphylococcus aureus，MRSA)活菌攻擊小鼠、盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)膿毒癥模型小鼠均具有顯著保護(hù)作用，該作用可能與其抑制TLR4、TLR9表達(dá)，降低LPS水平以及抑制NF-κB活性有關(guān)。
　　除具有顯著的抗炎作用外，有文獻(xiàn)報(bào)青蒿琥酯具有免疫調(diào)節(jié)作用。為研究青蒿琥酯是否可通過(guò)其免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮對(duì)膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的治療作用，本課題擬在建立內(nèi)毒素耐受及二

6、次打擊小鼠、細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為尋找有效治療膿毒癥的藥物并拓寬青蒿琥酯的臨床適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　一、小鼠內(nèi)毒素耐受模型的建立與評(píng)價(jià)
　　1.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的初步建立與評(píng)價(jià)
　　(1)模型的初步建立:連續(xù)5d腹腔注射1 mg/kg LPS后，于第6d尾靜脈注射50 mg/kg LPS。
　　(2)模型的評(píng)價(jià):通過(guò)觀察小鼠7d

7、死亡率;血清TNF-α及IL-6釋放水平;小鼠對(duì)大腸埃希菌敏感性變化;小鼠血液中細(xì)菌數(shù)量的變化評(píng)價(jià)模型。
　　2.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的優(yōu)化與評(píng)價(jià)
　　(1)模型的優(yōu)化:通過(guò)連續(xù)腹腔注射不同次數(shù)及不同劑量的LPS后，再尾靜脈注射50 mg/kg LPS，通過(guò)觀察小鼠體重及狀態(tài)變化確定最佳耐受模型的建立方案。
　　(2)模型的評(píng)價(jià):通過(guò)觀察小鼠7d死亡率;血清、肺及脾TNF-α、IL-6及IL-1β釋放水平的變化;小鼠對(duì)銅

8、綠假單胞菌敏感性變化評(píng)價(jià)模型。
　　1.細(xì)胞因子檢測(cè):采用ELISA法測(cè)定青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾TNF-α、IL-6及IL-1β釋放的影響。
　　2.死亡率觀察:通過(guò)統(tǒng)計(jì)小鼠7d死亡率，觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠死亡率的影響。
　　3.細(xì)菌清除能力研究:采用平板計(jì)數(shù)法觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠血液、肺和脾中細(xì)菌數(shù)量變化的影響。
　　三、青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠保護(hù)

9、作用機(jī)制的初步研究
　　1.體外研究
　　(1)內(nèi)毒素耐受細(xì)胞模型的建立與評(píng)價(jià):RAW264.7細(xì)胞加入5 ng/mL LPS預(yù)處理4h后再加入100 ng/mL LPS;采用ELISA法檢測(cè)上清TNF-α及IL-6釋放水平。
　　(2)細(xì)胞因子檢測(cè)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子檢測(cè):采用ELISA法分別檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞釋放TNF-α及IL-6的影響及其對(duì)NF-κB p65及p50活化的影響;采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)青蒿琥

10、酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞TLR4、TRAF6表達(dá)的影響。
　　(3)細(xì)菌清除能力研究:內(nèi)毒素耐受細(xì)胞加入5.0×106 CFU/mL銅綠假單胞菌建立內(nèi)毒素耐受二次打擊細(xì)胞模型;平板計(jì)數(shù)法觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型細(xì)胞細(xì)菌數(shù)量變化。
　　2.體內(nèi)研究
　　采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠肺和脾中重要信號(hào)分子TLR4、TRAF6蛋白表達(dá)及NF-κB p65蛋白活化的影響。
　　結(jié)果:

11、>　　一、小鼠內(nèi)毒素耐受模型的建立與評(píng)價(jià)
　　1.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的初步建立與評(píng)價(jià)
　　采用腹腔連續(xù)5d注射1 mg/kg LPS并于第6d尾靜脈注射50 mg/kg LPS，7d內(nèi)小鼠全部存活，表明模型建立基本成功;
　　耐受模型小鼠血清TNF-α及IL-6水平較50 mg/kg LPS攻擊小鼠明顯減少;導(dǎo)致耐受小鼠100％死亡的最低大腸埃希菌數(shù)量較正常小鼠明顯減少;細(xì)菌攻擊耐受小鼠血液中EC數(shù)量較單獨(dú)細(xì)菌攻擊小鼠

12、明顯增多。
　　2.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的優(yōu)化與評(píng)價(jià)
　　(1)腹腔注射0.3、1.0及3.0 mg/kg LPS預(yù)處理劑量?jī)H0.3 mg/kg LPS預(yù)處理3或5d后小鼠體重及狀態(tài)基本恢復(fù)，因此確定最佳建模方案為:腹腔連續(xù)3d注射0.3 mg/kg LPS后于第4d尾靜脈注射50 mg/kg LPS。
　　(2)耐受模型小鼠7d內(nèi)全部存活;耐受模型小鼠血清、肺和脾TNF-α、IL-6及IL-1β水平較50 mg/kg

13、LPS攻擊小鼠明顯減少;導(dǎo)致耐受模型小鼠100％死亡的最低銅綠假單胞菌劑量較正常小鼠明顯減少。
　　二、青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受及二次打擊模型小鼠的保護(hù)作用
　　1.青蒿琥酯呈劑量依賴(lài)性地增加內(nèi)毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾中TNF-α、IL-6及IL-1β的釋放。
　　2.青蒿琥酯呈劑量依賴(lài)性地降低內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠的7d死亡率。
　　3.青蒿琥酯顯著減少內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠血液、肺和脾中銅綠假單胞菌數(shù)

14、量。
　　三、青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠保護(hù)作用機(jī)制的初步研究
　　1.體外研究
　　(1)采用5 ng/mL LPS預(yù)處理4h后再用100 ng/mL LPS處理細(xì)胞建立內(nèi)毒素耐受模型，模型細(xì)胞TNF-α及IL-6釋放較100 ng/mL LPS處理組細(xì)胞明顯減少。
　　(2)青蒿琥酯呈濃度依賴(lài)性地增加內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞TNF-α及IL-6的釋放;AS可增加內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞中TLR4、TRAF6蛋白表達(dá)及N

15、F-κB p65蛋白活化;
　　(3)青蒿琥酯顯著減少內(nèi)毒素耐受二次打擊模型細(xì)胞內(nèi)銅綠假單胞菌數(shù)量。
　　2.體內(nèi)研究
　　青蒿琥酯可增加內(nèi)毒素耐受模型小鼠肺和脾中TLR4、TRAF6蛋白表達(dá)及NF-κB p65蛋白活化。
　　結(jié)論:
　　1.采用腹腔連續(xù)3d注射0.3 mg/kg的LPS并于第4d尾靜脈注射50 mg/kg的LPS能成功建立LPS耐受小鼠模型，該模型穩(wěn)定性好、重復(fù)性高，且造模周期最短、藥品

16、消耗最少。
　　2.青蒿琥酯可顯著提高內(nèi)毒素耐受模型小鼠致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β的釋放;青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠具有顯著的保護(hù)作用，可提高內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠對(duì)銅綠假單胞菌的清除能力。
　　3.青蒿琥酯可顯著提高內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞致炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-6的釋放;青蒿琥酯可提高內(nèi)毒素耐受二次打擊模型細(xì)胞對(duì)銅綠假單胞菌的清除能力。
　　4.青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠的