青蒿琥酯對(duì)小鼠造血干-祖細(xì)胞的毒性機(jī)制研究.pdf

1、青蒿素（arteannuin）是1971年由我國(guó)科學(xué)家從菊花科植物黃花蒿（Artemisia annua Linn）中提取而來的一種天然的倍半萜內(nèi)過氧化合物。經(jīng)多方面的研究證實(shí)，它是一種非常有效的抗瘧藥二氫青蒿素（dihydroartemisinin）的前體。根據(jù)其研發(fā)的第一代藥物為半合成的乙縮醛類青蒿素衍生物，其中包括蒿甲醚（artemether）、蒿乙醚（arteether）、青蒿琥酯（artesunat）等等。它們?cè)隗w內(nèi)均代謝成為

2、二氫青蒿素，臨床上主要用于抗瘧治療。青蒿琥酯為水溶性，與其它同類的藥物相比其抗瘧作用不但療效快、毒性小，而且劑型多樣，給藥方便，因此被廣泛應(yīng)用于惡性瘧治療和危重的腦型瘧搶救。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)青蒿琥酯的藥理活性進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其還具有抗腫瘤、抗病毒、抗纖維化、抗高血壓、抗血吸蟲、調(diào)節(jié)免疫等諸多藥理活性，尤其是其抗腫瘤作用研究目前正備受矚目。 與此形成鮮明對(duì)比的是，目前涉及其毒理學(xué)作用機(jī)制的研究深度卻十分有限。誠然，青蒿素衍

3、生物在實(shí)際臨床治療過程中的毒副作用不太常見，對(duì)孕婦也相當(dāng)安全，且目前的研究也沒有明確的證據(jù)證明其具有嚴(yán)重的副作用。但是在動(dòng)物研究中，大劑量青蒿素衍生物可明確表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用和一過性的造血系統(tǒng)抑制現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過研究初步證實(shí)其毒副作用機(jī)制與其藥理活性具有緊密聯(lián)系，使其在發(fā)揮藥理活性過程中殺傷‘?dāng)橙恕耐瑫r(shí)也將造成機(jī)體的損傷。從其作用機(jī)制推測(cè)，青蒿素類藥物毒副作用產(chǎn)生的最大原因可能在于其所具有的特殊的分子結(jié)構(gòu)。它被鐵離子活化后可釋

4、放出各種活性氧簇reactive oxygen species，ROS），產(chǎn)生自由基特異性或非特異性地?fù)p傷各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中包括細(xì)胞的遺傳物質(zhì)DNA、各種維持機(jī)體正常機(jī)能的關(guān)鍵蛋白質(zhì)、以及維持細(xì)胞活性所必需的各種膜類結(jié)構(gòu)和線粒體。除此之外，青蒿琥酯還可通過上調(diào)或下調(diào)某些功能基因的表達(dá)引致細(xì)胞正常生理功能紊亂使機(jī)體致病。但目前對(duì)該類藥物的基本毒性作用環(huán)節(jié)、作用靶標(biāo)，具體作用方式仍不甚明了，這將嚴(yán)重阻礙青蒿素類藥物臨床應(yīng)用的拓展。

5、為明確了解青蒿素類藥物具體的造血毒性作用環(huán)節(jié)及機(jī)制，本課題決定選擇水溶性青蒿素衍生物青蒿琥酯作用為研究對(duì)象。主要采用小鼠骨髓造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)作為研究手段，運(yùn)用多種先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究方法進(jìn)行探索，以期初步闡釋青蒿琥酯對(duì)造血干細(xì)胞的各種毒理學(xué)影響，并由此進(jìn)一步找出其具體的作用靶點(diǎn)，為該類藥物不斷應(yīng)用拓展打下基礎(chǔ)。 方法： 1．骨髓造血干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行半固體培養(yǎng)，添加適量E

6、PO（促紅細(xì)胞生成素）誘導(dǎo)其定向分化為紅系造血祖細(xì)胞，取造血祖細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)苯胺染色鑒定。 2．青蒿琥酯對(duì)造血干細(xì)胞定向分化的抑制作用。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行半固體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進(jìn)行干預(yù)，其中設(shè)一個(gè)溶劑對(duì)照組；光鏡下計(jì)數(shù)紅系集落形成單位（CFU-E）和紅系爆式集落形成單位（BFU-E）。 3．青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的影響。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯

7、藥物進(jìn)行干預(yù)，其中設(shè)一個(gè)溶劑對(duì)照組；分別于培養(yǎng)過程中的24h、48h、72h取出細(xì)胞進(jìn)行鐵染色，光鏡下計(jì)數(shù)出現(xiàn)鐵顆粒的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒的數(shù)目。 4．青蒿琥酯對(duì)小鼠造血干細(xì)胞DNA的損傷作用。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進(jìn)行干預(yù)，其中設(shè)一個(gè)溶劑對(duì)照組和一個(gè)H2O2陽性對(duì)照組；通過單細(xì)胞電泳檢測(cè)、熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)出現(xiàn)彗尾現(xiàn)象的細(xì)胞數(shù)目，評(píng)估拖尾程度。 5．凝膠電泳檢測(cè)造血干

8、/祖細(xì)胞的凋亡。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進(jìn)行干預(yù)，其中設(shè)一個(gè)溶劑對(duì)照組，分別于藥物干預(yù)12h、24h后提取細(xì)胞DNA作凝膠電泳檢測(cè)。 6．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進(jìn)行干預(yù)，其中設(shè)一個(gè)溶劑對(duì)照組，分別于藥物干預(yù)72h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。 7．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)骨髓造血干細(xì)胞線粒體

9、膜電位的影響。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進(jìn)行干預(yù)，其中設(shè)一個(gè)溶劑對(duì)照組，于藥物干預(yù)12h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。 8．電鏡觀察青蒿琥酯誘導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)損傷與細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 取小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行液體定向培養(yǎng)并加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進(jìn)行干預(yù)，其中設(shè)一個(gè)溶劑對(duì)照組，于藥物干預(yù)12h后固定液固定，透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)和線粒體的改變。 9．ALAS活

10、性的測(cè)定。 取成年大鼠肝臟線粒體加入不同濃度的青蒿琥酯藥物進(jìn)行干預(yù)，通過核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定NADH的吸光度（OD值）。 結(jié)果： 1．骨髓造血干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定。 造血干細(xì)胞分別經(jīng)過半固體或液體培養(yǎng)，并進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化后的觀察結(jié)果如下：半固體定向培養(yǎng)細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，紅系集落背景稍暗，集落內(nèi)細(xì)胞圓整，體積較小，細(xì)胞間緊密連接，因?yàn)榧?xì)胞漿內(nèi)有血紅素合成，集落可呈黃色或紅色。液體定向培養(yǎng)細(xì)胞在倒置顯微鏡下

11、觀察，紅系集落背景稍暗，集落內(nèi)細(xì)胞圓整，體積較小，細(xì)胞間連接較緊密，但比半固體培養(yǎng)集落松散，沉積于瓶底，不貼壁，集落周邊有散在的形態(tài)類似的集落脫落細(xì)胞，集落可呈黃色或紅色，也可無色。紅系造血祖細(xì)胞鑒定：細(xì)胞經(jīng)聯(lián)苯胺與蘇木素復(fù)染后胞漿呈紅褐色，胞核呈紫藍(lán)色。 2．青蒿琥酯對(duì)小鼠造血干細(xì)胞分化和抑制作用。 半固體定向培養(yǎng)的造血干細(xì)胞受藥物干預(yù)的結(jié)果表明，青蒿琥酯能明顯抑制造血干細(xì)胞向紅系造血祖細(xì)胞分化，并具有劑量依賴性關(guān)系，

12、兩個(gè)最大劑量組與溶劑對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。 3．青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的影響。 經(jīng)藥物干預(yù)的液定向體培養(yǎng)的造血干細(xì)胞進(jìn)行鐵染色結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)有鐵粒沉積現(xiàn)象，并具有劑量依賴性關(guān)系；細(xì)胞內(nèi)沉積的鐵粒絕大部分只1～2個(gè)，為Ⅰ型沉積；各藥物組與溶劑對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。 4．青蒿琥酯對(duì)小鼠造血干細(xì)胞DNA的損傷作用。 經(jīng)單細(xì)胞電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2陽性對(duì)照組細(xì)胞可見較明

13、顯的慧尾，陰性對(duì)照組基本無慧尾出現(xiàn)，各藥物組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的慧尾現(xiàn)象，但不如陽性對(duì)照組表現(xiàn)明顯，多為輕度損傷。 5．凝膠電泳檢測(cè)造血干/祖細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。 凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：不同劑量的青蒿琥酯（0．01mmol/L～2．60mmol/L）均可誘導(dǎo)骨髓造血干/祖細(xì)胞凋亡，凋亡條帶主要分布于500bp至2000bp之間。 6．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：青蒿琥酯用藥

14、72h后可引起細(xì)胞晚期凋亡/死亡，各用藥組與溶劑對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．000）；雙變量相關(guān)分析表明青蒿琥酯劑量與細(xì)胞晚期凋亡/死亡率呈正相關(guān)（Spearman's：r=0．960，P=0．000）。 7．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)線粒體膜電位（MMP）的影響。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：青蒿琥酯可引起造血干/祖細(xì)胞MMP顯著下降（LSDt-tests各組比較均為P<0．05），且MMP下降程度具有劑量依賴關(guān)系；雙變量相

15、關(guān)分析也表明青蒿琥酯劑量與MMP變化之間呈正顯著相關(guān)（r=0．546，P=0．018）。 8．電鏡觀察青蒿琥酯誘導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)損傷與細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 電鏡觀察結(jié)果表明：藥物作用后造血干細(xì)胞后可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變；線粒體出現(xiàn)不同程度的破壞，主要表現(xiàn)為線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)模糊或消失，或呈空泡樣改變。 9．ALAS活性的測(cè)定。 核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定NADH吸光度，結(jié)果表明青蒿琥酯能明顯增強(qiáng)ALAS的活性，且