青蒿琥酯影響Hela細(xì)胞免疫抑制物質(zhì)分泌的研究.pdf

1、目的：宮頸癌是婦科常見腫瘤中之一，全球每年約有30萬婦女死于此病，死亡率居世界首位。目前，在傳統(tǒng)的三大療法基礎(chǔ)上，宮頸癌的輔助免疫治療已成為近年來的研究熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞通過分泌免疫抑制物質(zhì)抑制免疫功能從而逃避免疫監(jiān)視，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。因此，研究下調(diào)腫瘤免疫抑制物質(zhì)分泌，尋找能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制的有效藥物，是開發(fā)抗瘤藥物、明確其抗瘤免疫機(jī)理和指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用的重要方面。中藥制劑青蒿琥酯ART具有一定的抗瘤作用，以往研究主要集中

2、在上調(diào)機(jī)體免疫功能指標(biāo)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或分化、影響腫瘤組織血管生成以及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制和細(xì)胞毒方面，而對(duì)其影響腫瘤細(xì)胞免疫抑制及相關(guān)物質(zhì)的分泌，從免疫抑制角度揭示其抗腫瘤機(jī)理的系統(tǒng)研究，國(guó)內(nèi)外尚少見報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清具有免疫抑制作用，是其分泌免疫抑制物質(zhì)所致，報(bào)道較多的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）β1、白介素（IL）10及前列腺素（PG）E2等，而對(duì)其分泌外來體（Exosomes）研究尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)ART對(duì)

3、Hela細(xì)胞免疫抑制物質(zhì)的影響，旨在揭示ART抗瘤新機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)具有我國(guó)特色和自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗癌中藥制劑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。
　　 方法：確定Hela細(xì)胞最佳接種濃度及培養(yǎng)時(shí)間后，MTT法篩選對(duì)Hela細(xì)胞無直接毒性的最高ART濃度。制備經(jīng)ART作用48h后的培養(yǎng)上清（ART-S），洗滌去除ART，收集連續(xù)兩次以新鮮培液進(jìn)行48h再培養(yǎng)的Hela細(xì)胞上清（分別稱為ART-S1、ART-S2），以不經(jīng)ART作用的相應(yīng)

4、同步培養(yǎng)的Hela細(xì)胞培養(yǎng)上清作對(duì)照（分別稱為Control-S、Control-S1、Control-S2）。定量ELISA法測(cè)定各上清中TGF-β1、IL-10的含量，紫外分光光度法測(cè)定PGE2的A278值；梯度離心法提取上清中的Exosomes，掃描電鏡下觀察其大小形態(tài)，紫外分光BCA法檢測(cè)蛋白定量的A280；統(tǒng)計(jì)分析ART下調(diào)Hela細(xì)胞免疫抑制靶分子分泌的種類和程度。
　　 結(jié)果：1.經(jīng)MTT法確定實(shí)驗(yàn)用Hela細(xì)胞接

5、種濃度為2×105/mL，培養(yǎng)時(shí)間為48h；2.經(jīng)MTT法確定實(shí)驗(yàn)用對(duì)Hela細(xì)胞無直接毒性作用ART最高濃度為3.13mg/L；3.未經(jīng)ART作用的Hela細(xì)胞可穩(wěn)定分泌所測(cè)的4種免疫抑制物質(zhì)，以TGF-β1含量最高，可達(dá)（989.226±34.836）ng/mL，IL-10的含量為（3.391±0.164）pg/mL，PGE2的含量為（1.318±0.076）pg/mL，Exosomes的OD280值為（0.178±0.027）。經(jīng)

6、ART作用后的Hela細(xì)胞，ART-S與Control-S相比，TGF-β1、IL-10、PGE2的含量明顯降低，分別為（2.859±0.520）ng/mL（P<0.001，僅為Control-S含量的0.29％）、（3.010±0.217）pg/mL（P<0.05，為Control-S含量的88.76％）、（1.147±0.931）pg/mL（P<0.05，為Control-S的58.43％）；Exosomes含量檢測(cè)值無顯著變化（0

7、.143±0.029，P>0.05）。其第一次48h再培養(yǎng)上清（ART-S1）與ART-S相比，TGF-β1、PGE2、Exosomes顯著降低，分別為（0.009±0.001）ng/ml（P<0.001，僅為Control-S1含量的0.00008％）、（1.129±0.916）pg/mL（P<0.05，為Control-S1的52.67％）、0.063±0.142（P<0.05，僅為Control-S的35.4％）；IL-10的含量

8、顯著回升（3.121±0.137）pg/mL（P<0.05）。其第二次48h再培養(yǎng)上清（ART-S2）與ART-S1相比，TGF-β1含量顯著回升（0.576±0.032）ng/mL（P<0.001），為Control-S2含量的0.06％；IL-10含量及PGE2含量無顯著變化，分別為（3.207±0.082）pg/mL（P>0.05）、（1.205±0.931）pg/mL（P>0.05）；Exosomes的含量與ART-S1相比明顯

9、回升（0.135±0.017，P<0.05），Exosomes蛋白定量顯示第二次48h再培養(yǎng)上清（ART-S2）但與Control-S2相比降低為Control-S2的75.84％。掃描電鏡觀察ART作用前后Hela細(xì)胞分泌Exosomes的大小、形態(tài)無明顯差別。
　　 結(jié)論：
　　 1.Hela細(xì)胞可穩(wěn)定分泌所測(cè)4種免疫抑制物質(zhì)。
　　 2.ART可下調(diào)Hela細(xì)胞分泌免疫抑制物質(zhì)TGF-β1、IL-10、PG