青蒿琥酯對白血病細胞β-catenin信號通路相關基因影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　 我國白血病發(fā)病率為2.76/10萬,在惡性腫瘤死亡率中,白血病居第6位(男性)和第8位(女性),在兒童及35歲以下成人中則居第一位,且近年來發(fā)病率呈上升趨勢?？v觀近40年來急性白血病的治療進展,盡管60～80％初發(fā)白血病患者(非M3)可獲得臨床完全緩解(CR),但是仍有大于50％的緩解患者在治療1～2年內(nèi)復發(fā),體內(nèi)的白血病細胞對化療藥物出現(xiàn)耐藥,導致治療失敗。難治、殘留、復發(fā)仍然是白血病治療的巨大障礙和亟待解決

2、的難題。近年來,砷劑在急性早幼粒細胞白血病中的應用為中草藥抗腫瘤治療開創(chuàng)了新紀元,中草藥在世界醫(yī)學中的影響越來越大,開發(fā)有效的天然抗腫瘤藥物成為腫瘤治療的熱點之一。
　　 青蒿素類衍生物青蒿琥酯(Artesunate ART)能夠通過血腦屏障、高效、低毒、脂溶性好、抗瘧活性高等特性使之成為世界范圍的抗瘧疾首選藥。目前國內(nèi)外大量研究表明,其在體內(nèi)外對多種腫瘤細胞有選擇性殺傷作用,而對人體正常細胞作用輕微；且其與已知的傳統(tǒng)抗癌化療藥

3、如長春新堿、甲氨蝶呤、羥基脲等作用機制不同,因此可與傳統(tǒng)抗癌化療藥物合用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)ART可在體內(nèi)外抑制腫瘤血管形成,進而干擾腫瘤微環(huán)境,導致腫瘤細胞增殖受抑,但其在分子水平的具體作用機制尚需進一步探討。Efferth等用55種人源性腫瘤細胞系檢測青蒿琥酯的抗癌活性,發(fā)現(xiàn)白血病細胞和大腸癌細胞對其最為敏感。進一步文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn),白血病細胞和大腸癌細胞存在一個共同特點,即β-catenin信號通路的表達失調(diào)。β-catenin

4、信號轉導途徑的激活在維系干細胞的增殖、細胞的分化、體軸的發(fā)育、細胞的不對稱分裂等許多生物發(fā)育過程中具有重要作用,隨著對其在分子生物學領域作用研究的深入,研究發(fā)現(xiàn)β-catenin信號通路在淋巴細胞以及造血干細胞的發(fā)育中也具有重要作用,而且越來越多的證據(jù)表明這一途徑可能與維持白血病干細胞(leukemia stem cell,LSC)的自我更新和增殖分化密切相關。
　　 在本課題組前期工作中,利用基因芯片技術研究了慢性髓系白血病(

5、chronic myeloid leukemia,CML)患者急變期和慢性期基因表達變化,并進一步利用生物信息學對差異表達基因進行數(shù)據(jù)挖掘,結果發(fā)現(xiàn),wnt信號通路在CML疾病進展過程中扮演了重要角色,其中β-catenin處于CML急變相關基因和轉錄因子網(wǎng)絡調(diào)控的核心位置。β-catenin蛋白是一個多功能蛋白,至少存在3種不同的細胞定位,可以發(fā)揮兩種相對獨立的生物學功能。正常細胞中,細胞膜上的β-catenin與E-cadherin

6、相互連接,維持上皮細胞的完整性；胞漿內(nèi)游離β-catenin水平較低,不能進入細胞核調(diào)控癌基因表達。在腫瘤細胞中,胞漿內(nèi)游離的β-catenjn異常積累,激活下游靶基因如c-myc、CyclinD1等基因轉錄,啟動腫瘤生長程序；另一方面還會直接誘導E-cadherin的表達缺失,從而導致上皮細胞發(fā)生上皮-間葉轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促進腫瘤細胞轉移。
　　 E-cadh

7、erin是依賴Ca2+的細胞粘附分子超家族成員之一,表達于骨髓基質細胞和CD34+造血干細胞,介導造血細胞與骨髓基質細胞的相互作用,是骨髓微環(huán)境的重要組成部分。細胞膜上E-cadherin的表達缺失能使白血病細胞從彼此的連接中解離、遷移出來,并破壞造血微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),使白血病細胞獲得侵襲性表型,導致白血病細胞脫離其它細胞的黏附并進一步分散和轉移。因此,β-catenin信號通路相關基因是介導白血病細胞與其微環(huán)境“crosstalk”的關鍵

8、網(wǎng)絡調(diào)控分子之一。
　　 因此我們猜測,青蒿素的抗白血病活性可能與β-catenin信號通路密切相關。有必要深入探討β-catenin信號通路與白血病發(fā)生發(fā)展的關系以及青蒿琥酯抗白血病活性是否與β-catenin信號通路相關,為明確青蒿素衍生物的作用機理及臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.挖掘CML急變相關基因,旨在進一步探討CML急變機制。
　　 2.檢測白血病患者E-cadherin

9、和β-catenin mRNA的相對表達水平,并探討其臨床意義,旨在進一步探討β-catenin通路相關基因在白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 3.檢測青蒿琥酯作用前后白血病細胞內(nèi)E-cadherin和β-catenin蛋白定位的變化以及E-cadherin、β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白的表達變化,初步探討青蒿琥酯對β-catenin信號通路相關蛋白的影響。為青蒿琥酯應用于臨床提供新的實驗依據(jù)和理論基礎。

10、
　　 研究方案
　　 1.應用生物信息學方法挖掘基因芯片數(shù)據(jù),探討CML急變可能涉及到的相關基因和信號通路。
　　 2.應用Realtime-PCR法分別檢測75例初診AML患者、68例ALL患者和20例非惡性血液病(對照組)中E-cadherin和β-catenin mRNA的表達,采用2-Δct法對PCR結果進行計算,分析E-cadherin和β-catenin mRNA表達與患者臨床特征和療效的關系。

11、r>　　 3.選取U937、K562和MOLT-4白血病細胞為研究對象,分別設濃度為0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml青蒿琥酯作用三種白血病細胞24h、48h和72h,MTT法檢測各組OD值,計算、比較各處理組細胞的增殖抑制率,并分別計算IC50值；Hoechst33342染色法觀察細胞形態(tài)變化；Annexin V/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡率；以確定青蒿琥酯對LJ937、K562和MOLT

12、-4白血病細胞的最佳處理條件。
　　 4.分別應用半定量RT-PCR檢測U937、K562和MOLT-4白血病細胞系E-cadherin基因CDH1的表達,并應用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測CDH1是否處于甲基化狀態(tài)。
　　 5.濃度為0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml青蒿琥酯分別作用于U937、K562和MOLT-4細胞48h,應用western-blotting方法檢測不同濃度ART作用下

13、三種細胞中E-cadherin、β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白的表達變化,探討青蒿琥酯對β-eatenin信號通路相關蛋白的影響。
　　 6.分別設濃度為0、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml青蒿琥酯作用于U937、K562和MOLT-4細胞48h后,應用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察U937、K562和MOLT-4細胞中E-cadherin、β-eatenin蛋白定位的變化。
　　

14、 7.統(tǒng)計方法:應用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)分析,E-cadherin、β-catenin mRNA表達在急性白血病患者和對照組不符合正態(tài)分布,用中位數(shù)描述。急性白血病與對照組、AML各亞型、ALL各亞型與對照組間及兩兩比較采用非參數(shù)檢驗中的Mann-Whitney U檢驗；AML各亞型間整體比較采用Kruskal-Wallis H檢驗；E-cadherin、β-catenin mRNA表達與臨床特征之間的關系用spearman相

15、關性分析；E-cadherin、β-catenin基因高表達與低表達組間完全緩解率、難治白血病發(fā)生率、1年內(nèi)死亡率比較用x2檢驗,1年中位生存時間比較Log rank檢驗；用Kaplan.Meier法進行生存分析。細胞株E-cadherin、β-catenin表達以(x)+S描述,由于方差齊,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,組內(nèi)多重比較用LSD法。藥物處理組及空白對照組細胞在增殖抑制率、凋亡方面的比較由于方差齊,采用單因素方差分析。以P

16、<0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 結論
　　 1.利用DAVID軟件對基因芯片篩選的差異表達基因進行功能富集聚類,發(fā)現(xiàn)粘附相關分子和。wnt通路與CML急變密切相關,進一步采用Genomatix軟件對各類基因集和相應轉錄因子構建了轉錄調(diào)控網(wǎng)絡,可明確找出那些處于核心位置的基因和轉錄因子,其中β-catenin位于核心位置,表明wnt/β-catenin信號通路參與CML急變。
　　 2.急性白血病患者E-cadh

17、erin表達顯著低于非惡性血液病患者,β-catenin表達顯著高于非惡性血液病患者。
　　 3.E-cadherin、β-catenin基因表達水平與AML患者細胞遺傳學預后危險度相關,且與B-ALL患者中BCR/ABL融合基因密切相關；T-ALL患者的E-cadherin表達水平較B-ALL低,β-catenin表達水平較B-ALL高.
　　 4.β-catenin表達水平與AML患者LDH、骨髓原幼稚細胞比例呈正相

18、關,與ALL患者初發(fā)WBC數(shù)呈正相關,E-cadherin、β-catenin基因表達水平與髓外浸潤密切相關；β-catenin高表達組難治性白血病發(fā)生率較高。
　　 5.青蒿琥酯能夠誘導U937、K562、MOLT-4細胞凋亡,且呈時間和濃度依賴性。
　　 6.E-cadherin在白血病細胞中不表達或極低表達,可能與其啟動子區(qū)甲基化有關。
　　 7.青蒿琥酯可能通過恢復E-cadhefin蛋白的表達,募集β-