細(xì)胞酸堿內(nèi)環(huán)境對(duì)白血病細(xì)胞分化及耐藥的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景:伊馬替尼(格列衛(wèi)STI571)是目前治療CML的有效藥物。但原發(fā)或繼發(fā)性耐藥是CML尤其是急變期患者應(yīng)用伊馬替尼遇到的最大問(wèn)題。為此,進(jìn)一步探討和了解BCR/ABL下游的分子網(wǎng)絡(luò),尋找不依賴BCR/ABL激酶的新的有效治療靶點(diǎn)有望解決這一耐藥問(wèn)題。
　　 目的:根據(jù)我們已報(bào)道的研究結(jié)果表明,特異性抑制鈉氫交換蛋白1(NHE1)所致的細(xì)胞內(nèi)酸化能有效逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白(PgP)介導(dǎo)的白血病細(xì)胞多藥耐藥。而伊馬替尼已被證明是PgP

2、的底物,其介導(dǎo)的藥物外排是CML患者耐伊馬替尼的機(jī)制之一。因此本研究意在探討NHE1與Pgp在CML患者中的關(guān)系及在耐藥中的作用。
　　 方法:對(duì)2008年10月～2010年9月我院收治的CML患者19例、急性髓系白血病AML9例、急性淋巴細(xì)胞白血病ALL11例進(jìn)行研究,并收集5例正常供者骨髓為陰性對(duì)照。分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定患者原代白血病細(xì)胞內(nèi)pH值(Intracellular pH,pHi),實(shí)時(shí)定量R

3、T-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)Pgp基因及蛋白表達(dá),并統(tǒng)計(jì)pHi與Pgp表達(dá)的相關(guān)性。用NHE1特異性抑制劑Cariporide及高鉀緩沖溶液對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行酸化處理后,共聚焦及實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)患者細(xì)胞內(nèi)pH值以及Pgp表達(dá)水平的變化,流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光染料羅丹明123(Rh123)及阿霉素(DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,MTT及集落形成實(shí)驗(yàn)考查細(xì)胞對(duì)藥物敏感性。并進(jìn)一步考察Cariporide及高鉀緩沖溶液

4、對(duì)原代白血病細(xì)胞ERK1/2、ERK5、p38 MAPK、JNK磷酸化水平的改變。繼而利用NHE1抑制劑和高鉀緩沖溶液對(duì)敏感株K562及耐藥株K562/DOX,K562/G01細(xì)胞系進(jìn)行處理,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH值(Intracellular pH,pHi),羅丹明123(Rh123)及阿霉素(DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,P-糖蛋白(Pgp)基因表達(dá)變化,Pgp蛋白水平以及ERK1/2、p38 MAPK、JNK磷酸化水平。進(jìn)一步應(yīng)用ERK1/2、

5、p38 MAPK、JNK特異性抑制劑PD98059、SB203580、SP600125以及siRNA干擾的方法考察MAPK信號(hào)通路在該過(guò)程中的作用。
　　 結(jié)果:細(xì)胞內(nèi)pH值測(cè)定顯示,BCR-ABL陽(yáng)性和陰性組細(xì)胞內(nèi)pH值均高于正常組,相關(guān)性分析顯示BCR-ABL陽(yáng)性組細(xì)胞內(nèi)pH值與Pgp基因表達(dá)呈正相關(guān)(r2=0.3439),而BCR—ABL陰性組細(xì)胞內(nèi)pH值與Pgp基因表達(dá)無(wú)相關(guān)性。將BCR-ABL陽(yáng)性樣本分為初治及復(fù)發(fā)組,

6、初治組細(xì)胞內(nèi)pH值平均為7.11,明顯低于復(fù)發(fā)組的7.32。與初治組相比,復(fù)發(fā)組Pgp基因及蛋白均有不同程度的過(guò)表達(dá),用NHE1特異性抑制劑Cariporide及高鉀緩沖溶液處理患者細(xì)胞后,復(fù)發(fā)組患者細(xì)胞內(nèi)pH值水平下降,PgpmRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),Rh123及阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積增加,且對(duì)伊馬替尼的敏感性增強(qiáng),而初治組中未見(jiàn)明顯變化。隨著細(xì)胞內(nèi)pH的降低,復(fù)發(fā)組p38MAPK及ERK5蛋白激酶磷酸化水平呈下降趨勢(shì),ERK1/2及JN

7、K蛋白激酶磷酸化水平呈上升趨勢(shì)。初治組ERK1/2及JNK蛋白激酶磷酸化水平同樣呈上升趨勢(shì),而p38 MAPK及ERK5蛋白激酶磷酸化水平未見(jiàn)顯著改變。Pgp高表達(dá)的耐藥株K562/DOX及K562/G01細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH值顯著高于敏感株K562細(xì)胞(P<0.05),且K562/DOX伴隨較強(qiáng)的Rh123及DOX外排能力。抑制NHE1活性可有效增強(qiáng)K562/DOX及K562/G01細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性,并抑制細(xì)胞中Pgp基因及蛋白水平

8、的表達(dá)(P<0.05)；另外抑制NHE1活性可顯著減少K562/DOX細(xì)胞內(nèi)Rh123和DOX的外排,且具有細(xì)胞內(nèi)pH值及時(shí)間依賴性。而敏感株K562細(xì)胞中Pgp表達(dá)及藥物外排能力并不受NHE1抑制劑的影響(P>0.05)。隨著細(xì)胞內(nèi)pH的降低,K562/DOX及K562/G01細(xì)胞中p38 MAPK蛋白激酶磷酸化水平呈下降趨勢(shì),ERK1/2蛋白激酶磷酸化水平呈上升趨勢(shì),JNK蛋白激酶磷酸化水平呈上升趨勢(shì)。特異性的p38 MAPK抑制劑

9、SB203580可與NHE1抑制劑協(xié)同下調(diào)Pgp基因及蛋白水平的表達(dá)。另外,ERK1/2蛋白激酶抑制劑PD98059及JNK蛋白激酶抑制劑SP600125可致p38 MAPK蛋白激酶磷酸化水平上升,提示ERK1/2和JNK可能抑制p38 MAPK激酶的活性。
　　 結(jié)論:抑制NHE1活性能夠顯著降低BCR-ABL陽(yáng)性患者細(xì)胞中Pgp蛋白表達(dá)和功能,增加Rh123及阿霉素在細(xì)胞中的累積,并增加細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性,為逆轉(zhuǎn)CML耐