RNA干擾對(duì)白血病細(xì)胞WT1基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)又稱基因沉默是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。它通過一段雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)致同源mRNA降解，從而使目的基因表達(dá)下調(diào)，是生物體內(nèi)的一種進(jìn)化保守機(jī)制。相關(guān)研究已證明21bp的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)。通過制備特定的siRNA，導(dǎo)入生物體內(nèi)可以有目的地抑制靶基因的表達(dá)，因此RNAi可用于基因功能分析

2、、治療病毒感染、治療腫瘤以及其它基因相關(guān)性疾病方面的研究。在白血病中，研究者使用針對(duì)BCR-ABL的siRNA可有效地抑制BCR-ABL在白血病細(xì)胞中的表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 Wilms'瘤基因(Wilms'tumorgene,WT1)最初被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，但在人類白血病細(xì)胞中呈異常高表達(dá)，其表達(dá)水平與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。WT1基因的反義寡核苷酸可抑制白血病細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該基因在發(fā)育分化和白血病生成中起重要作用。

3、 本研究采用WT1siRNA抑制WT1基因在K562細(xì)胞株中的表達(dá)，觀察抑制K562細(xì)胞中WT1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，從而探討癌基因WT1在白血病中作為腫瘤基因治療靶位以及WT1基因相關(guān)藥物開發(fā)的可能性，為白血病的基因治療提供新的思路。 材料與方法 訂購(gòu)化學(xué)合成3條WT1siRNAs，同時(shí)將K562細(xì)胞置于10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3d更換培養(yǎng)液、按

4、1∶3傳代。取指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)開始前12h更換新鮮無(wú)抗生素培養(yǎng)液。 實(shí)驗(yàn)分兩步： (1)使用GADPHsiRNA優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。設(shè)3個(gè)濃度組，分別為10nM/孔試驗(yàn)組、20nM/孔試驗(yàn)組和30nM/孔試驗(yàn)組。每次試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)對(duì)照組，即陰性對(duì)照組(陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照組。使用細(xì)胞存活率檢測(cè)和RT-PCR結(jié)果來(lái)尋找最合適的轉(zhuǎn)染濃度。 (2)以最佳轉(zhuǎn)染濃度將3組WT1-siRNAs導(dǎo)入細(xì)胞，每次試驗(yàn)設(shè)兩

5、個(gè)對(duì)照組，即陰性對(duì)照組(陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照組。與對(duì)照組比，使用RT-PCR測(cè)定3組WTlsiRNA介導(dǎo)的WTlmRNA的抑制。除了檢測(cè)WTlmRNA的表達(dá)水平，使用形態(tài)學(xué)觀察、MTT和流式細(xì)胞學(xué)評(píng)估細(xì)胞增殖和凋亡情況。 結(jié)果 (1)以不同濃度GADPHsiRNA處理細(xì)胞后，各濃度轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生存率和GADPHmRNA表達(dá)下調(diào)程度均不同。隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，細(xì)胞生存率逐漸增高。但最高的轉(zhuǎn)染濃度(30nM/孔)在

6、轉(zhuǎn)染后不超過6小時(shí)就導(dǎo)致了細(xì)胞死亡的出現(xiàn)。與對(duì)照組無(wú)明顯改變相比，20nM/孔的試驗(yàn)組GADPHmRNA表達(dá)的下調(diào)最為明顯。使用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在20nM/孔試驗(yàn)組GADPHmRNA表達(dá)下降60～80％。 (2)以最佳轉(zhuǎn)染濃度(20nM/孔)轉(zhuǎn)染W(wǎng)TlsiRNA。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，WTlsiRNA3能顯著減少GAPDHmRNA水平70～80％。使用瑞吉氏染色，可以看到典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。MTT結(jié)果示W(wǎng)TlsiRNA能抑制K5

7、62細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)到導(dǎo)入WTlsiRNA48小時(shí)后細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些結(jié)果表明了與對(duì)照組相比，化學(xué)合成的WTlsiRNA在K562細(xì)胞中能顯著地抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論 1本研究證實(shí)了WTl基因在白血病中的癌基因的功能?；瘜W(xué)合成WTlsiRNA在體外能夠通過降低WTlmRNA的表達(dá)水平，有效抑制白血病細(xì)胞增殖并適度提高其凋亡率，預(yù)示siRNA介導(dǎo)的RNAi在基因異常激活和過度表達(dá)性疾病以及抗腫瘤的基因治

8、療方面具有應(yīng)用的前景。雖然盡管WTlsiRNA能有效地抑制WTl表達(dá)，但并不能完全地沉默靶基因。 2通過WTlsiRNA各試驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡影響效果的不同，提示W(wǎng)Tl基因可能在導(dǎo)致和影響腫瘤形成的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制中起一定的作用，這一作用可使得腫瘤治療能起到一個(gè)網(wǎng)絡(luò)連鎖反應(yīng)，從而提高腫瘤治療的效果。 3本研究發(fā)現(xiàn)RNAi效應(yīng)具有濃度和時(shí)間依賴性。即對(duì)siRNA的量有一定的依賴性，一定范圍內(nèi)，隨著siRNA增高，RNAi效果增強(qiáng)