WT1多肽致敏樹突狀細胞誘導CTLs殺傷白血病細胞體外實驗研究.pdf

1、人體免疫監(jiān)視功能與腫瘤的發(fā)生密切相關，腫瘤具有多種逃避機體免疫應答的機制，目前認為，重要的是抗原遞呈功能不足，以致產(chǎn)生的效應細胞很難識別和殺滅腫瘤細胞。樹突狀細胞(DC)是目前已知體內(nèi)功能最強的專職抗原遞呈細胞(APC)，被認為是體內(nèi)唯一能活化靜息T細胞的抗原遞呈細胞，是特異性免疫應答的始動者，控制著體內(nèi)免疫反應過程。以DC為中心的免疫治療成為腫瘤生物免疫學治療熱點之一。隨著化療及造血干細胞移植技術的改進，白血病治療的緩解率明顯提高，但

2、仍有較多患者因復發(fā)而死亡。一般認為復發(fā)的根源主要原因是機體白血病微小殘留病(MRD)。清除MRD依耐效應T細胞對白血病抗原的識別及高效的抗原遞呈。白血病患者化療后機體處于免疫抑制狀態(tài)，白血病細胞雖表達MHC分子但其水平降低，缺乏協(xié)同刺激分子及粘附分子，白血病細胞抗原的免疫原性下降，抗原遞呈作用弱，且白血病患者體內(nèi)DC的成熟受阻，抗原遞呈等功能受損，不能有效啟動針對白血病有效的免疫應答。近年來研究證實各種形式的腫瘤抗原致敏DC后可以在體內(nèi)

3、外誘導出腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)，發(fā)揮最大限度特異性抗腫瘤效應，進而清除腫瘤病灶，使防止復發(fā)成為可能。細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞是一種新型、高效的具有廣譜殺瘤活性的免疫效應細胞，具有極強的增殖能力。1900年Call等從Wilms瘤細胞中分離出Wilms腫瘤基因(WT1)，其基因定位于染色體11P13。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人類各種白血病中有WT1基因異常表達或缺陷，與白血病的發(fā)生、發(fā)展和預后有很大關系。WT1多肽是已經(jīng)

4、鑒定出的白血病多肽，GaoL等用WT1多肽致敏T淋巴細胞后能選擇性清除慢性粒細胞白血病CD34+祖細胞。WT1多肽是一個可用于誘導特異性CTLs的腫瘤相關抗原。CD40L是人類DC成熟重要刺激信號，sCD40L在體外不僅具有顯著的誘導DC分化，促進DC成熟的功能，而且經(jīng)sCD40L作用的DC能更有效地激發(fā)T細胞。本研究組前期實驗研究中聯(lián)合應用GM-SCF、IL-4和TNF-α培養(yǎng)出DC[1，2]，并用WT1多肽負載DC誘導CTLs，對K

5、562細胞顯示高殺傷率。 研究目的 1.聯(lián)合應用細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等由健康人外周血單核細胞誘導培養(yǎng)DC，從形態(tài)學、細胞免疫表型、混合淋巴細胞增殖反應等方面對DC進行鑒定，觀察CD40L對DC免疫功能的影響。 2.研究DC分別負載WT1多肽抗原及不同白血病細胞凍融抗原(K562細胞、HL-60細胞和Jurkat細胞)，與經(jīng)IL-2、INF-γ等誘導的淋巴細胞共培

6、養(yǎng)，體外誘導產(chǎn)生特異性細胞毒性T淋巴細胞，觀察CTLs對白血病細胞的特異性殺傷效應，比較WT1多肽與凍融抗原負載DC誘導CTLs殺傷白血病細胞的差異。 結論 1.通過聯(lián)合應用細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等由健康人外周血單核細胞誘導活化出DC，倒置顯微鏡觀察具有典型樹突狀形態(tài)特征；流式細胞儀檢測表達高水平的共刺激分子；混合淋巴細胞反應顯示其具有極強的刺激同種異體淋巴細胞增殖反應的

7、能力。表明經(jīng)細胞因子誘導得到的DC具有極強的免疫原性。 2.通過聯(lián)合應用細胞因子rhIL-2、rhINF-γ等誘導培養(yǎng)淋巴細胞為淋巴細胞，并與DC共培養(yǎng)，流式細胞儀檢測CD3+CD8+、CD3+CD28+、CD3+CD8+CD28+及CD3+CD56+細胞群有所增加。 3.聯(lián)合應用CD40L能上調(diào)DC免疫刺激分子表達，提高DC免疫原性，增強活化CTLs能力。 4.分別用WT1多肽抗原及K562、HL60和Jurk

8、at細胞凍融抗原沖擊致敏DC，WT1多肽抗原及凍融抗原在不同效靶比下，致敏DC所激發(fā)的CTLs在不同效靶比下對K562、HL60或Jurkat細胞的殺傷率均高于單純DC組和單核細胞對照組(P＜0.01)，且在每一組中，它們所激發(fā)的CTLs殺傷活性均隨著效靶比的提高而相應提高，顯示了殺傷活性的量效關系。 5.WT1多肽抗原與凍融抗原致敏DC組間兩兩比較(P＞0.05)不具有統(tǒng)計學意義，可見WT1多肽抗原與K562、HL60或Jur