人類白血病細(xì)胞中WT1及其下游基因的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、目的1探討WT1基因啟動子和增強(qiáng)子調(diào)控基因表達(dá)的組織特異性；2探討RbAp46基因在白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用；3探討IGFBP-rP1基因與白血病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系?！　》椒ā?利用DNA重組技術(shù)分別構(gòu)建含WT1基因啟動子和增強(qiáng)子的載體。2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，堿裂解法抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，利用QIAGEN去內(nèi)毒素大劑量質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒。3優(yōu)化電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，分別將含有WT1基因啟動子、WT1基因啟動子和增強(qiáng)子及空載體的質(zhì)

2、粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株中，包括WT1基因高表達(dá)的造血細(xì)胞株K562、NB4、THP-1、SHI-1，WT1基因低表達(dá)的造血細(xì)胞株U937、Jurkat；WT1基因高表達(dá)的非造血細(xì)胞株MCF-7、T47D、293，WT1基因低表達(dá)的非造血細(xì)胞株ECV304、SMMC7721、HT-29、SHG44。4合適劑量的G418篩選2-4周，用流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白的平均熒光強(qiáng)度。5優(yōu)化SYBRGreenⅠ實時定量PCR條件，分別從DNA和RNA的水

3、平檢測質(zhì)粒整合和表達(dá)的水平。6優(yōu)化SYBRGreenⅠ實時定量PCR檢測RbAp46基因的條件。7建立實時定量PCR篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的方法。8實時定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)WTA的U937和NB4細(xì)胞株中WT1及RbAp46基因的表達(dá)水平。9利用脂質(zhì)體將全長RbAp46基因的cDNA轉(zhuǎn)染人類白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞和人腦膜膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44，利用有限性稀釋方法和克隆柱挑選單克隆細(xì)胞，以RbAp46基因過度表達(dá)的K562單克隆細(xì)胞和SHG