體外培養(yǎng)DC-CIK細(xì)胞殺傷白血病細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:以往白血病的細(xì)胞免疫治療的細(xì)胞來(lái)源均為緩解期的白血病患者，未緩解或初治白血病患者外周血存在一定比例的白血病細(xì)胞，能否激發(fā)出抗腫瘤CIK細(xì)胞值得進(jìn)一步探討。分別收集緩解期急性白血病患者、未緩解白血病患者的外周血，提取單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，觀察DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞的增殖能力、免疫膜標(biāo)變化以及抗白血病細(xì)胞的效應(yīng)?；旌吓嘤龢?shù)突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，比較緩解期與未緩解期患者來(lái)源的CIK細(xì)胞特性變化和殺

2、滅瘤細(xì)胞活性，探索生物過(guò)繼醫(yī)療收獲效應(yīng)細(xì)胞的較合理方法。
　　方法:DC細(xì)胞的培養(yǎng):采取未緩解期和緩解期急性白血病患者的外周血，經(jīng)肝素抗凝后，用H-F(Hypaque-Fieoll)淋巴細(xì)胞分離液（相對(duì)密度為1.077±0.001），分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearn cells，MNC)。然后用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×106/ml，孵育4小時(shí)后，取貼壁細(xì)胞，加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕

3、吹打，將瓶壁上細(xì)胞吹起，離心洗滌，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×106/ml，然后用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入細(xì)胞因子，使重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)濃度為1000U/ml、重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)濃度為1000 U/ml。然后放入培養(yǎng)箱中培育，適時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基和細(xì)胞因子，并計(jì)數(shù)。在DC細(xì)胞培養(yǎng)第6天，加重組人腫瘤壞死因子-a(rhTNF-a)，使?jié)舛葹?000U/ml，促

4、進(jìn)DC細(xì)胞成熟。
　　CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng):同上來(lái)源的細(xì)胞經(jīng)過(guò)單個(gè)核細(xì)胞的分離，然后用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×106/ml，孵育4小時(shí)后，收集懸浮的細(xì)胞，用含10％小牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)RPMI1640液將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，經(jīng)37℃、5％CO2培養(yǎng)，分別于第1天、第2天加入不同的細(xì)胞因子，以后隔日更換新的培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，同時(shí)補(bǔ)充加入重組人白細(xì)胞介素-2(rh-in

5、terleukin-2，rhIL-2)。培育第7天，用臺(tái)盼藍(lán)排斥法染色DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的RPMI1640液）調(diào)整DC細(xì)胞濃度為1×106/ml，CIK細(xì)胞濃度為5×106/ml，按照1∶5比例混合，繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第1天、第9天、第12天、第15天收集共培養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，測(cè)定生物學(xué)活性。
　　結(jié)果:
　　1緩解組與未緩解組來(lái)源的DC-CIK細(xì)胞增殖能力的比較
　　通過(guò)觀察

6、混合培育樹(shù)突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞后，比較緩解組與未緩解組細(xì)胞的增生性能、細(xì)胞毒性、表面標(biāo)識(shí)分子。在溫箱中孵育過(guò)的貼壁單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)成樹(shù)突狀細(xì)胞，培育中細(xì)胞外形發(fā)生鮮明變化，細(xì)胞量亦有明顯增加。培育第二天細(xì)胞體積增長(zhǎng)，邊緣發(fā)出胞漿突起，外形不規(guī)整，隨著培育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞邊緣突起增多，變長(zhǎng)，并成簇成團(tuán)生長(zhǎng)（見(jiàn)圖1）。
　　非粘附單個(gè)核細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的刺激誘導(dǎo)下，部分淋巴樣細(xì)胞明顯擴(kuò)增成CIK細(xì)

7、胞，并逐漸形成細(xì)胞團(tuán)塊;細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞，最初散在均勻分布，個(gè)頭小，亮而圓，形體較一致（見(jiàn)圖2）。在培養(yǎng)的第4天，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始呈現(xiàn)出不規(guī)則形，并呈團(tuán)簇生長(zhǎng)（見(jiàn)圖3）。從培養(yǎng)的第6天起，細(xì)胞明顯增殖，成叢或以集落狀態(tài)生長(zhǎng)，并懸浮于培養(yǎng)基中（見(jiàn)圖4）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞叢和細(xì)胞集落數(shù)增多。
　　在細(xì)胞培養(yǎng)的第6天將DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)得DC-CIK細(xì)胞，比較各組的免疫表型和生物活性的變化。細(xì)胞培養(yǎng)第9天，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥法活細(xì)

8、胞計(jì)數(shù)，緩解組DC-CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)為(16.39±1.89)，未緩解組DC-CIK增生了(17.0±2.16)倍;第12天，緩解組DC-CIK細(xì)胞數(shù)為原來(lái)的(42.6±3.93)倍，未緩解組是原來(lái)的(40.2±2.97)倍。第15天，DC-CIK（緩解組）細(xì)胞總數(shù)為原來(lái)的(65.2±1.81)倍，未緩解組細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增了(65.4±2.56)倍。分析比較同一組細(xì)胞的增殖倍數(shù)隨時(shí)間的增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（見(jiàn)表1）即兩組CIK細(xì)胞均在樹(shù)突

9、狀細(xì)胞輔助下快速增殖，增殖速度差別不大。鏡下可見(jiàn)DC與較多的CIK細(xì)胞聚集成團(tuán)（見(jiàn)圖5），呈團(tuán)塊生長(zhǎng)。
　　2緩解組與未緩解組來(lái)源的DC-CIK細(xì)胞分子表型的變化
　　分別收集培養(yǎng)第1天、第9天、12天及15天的兩組培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型分析。結(jié)果顯示:分離細(xì)胞當(dāng)天測(cè)得緩解組和未緩解組細(xì)胞的免疫表型結(jié)果如下:CD3+CD8+細(xì)胞分別為(23.4±5.36)％，(21.8±7.32)％，CD3+CD56+細(xì)胞分別為

10、(3.81±1.35)％，(4.01±1.63)％。培養(yǎng)的第9天、12天、15天培養(yǎng)物的免疫表型檢測(cè)結(jié)果如下:緩解組CD3+CD8+細(xì)胞分別為(53.0±1.58)％，(71.2±2.59)％，(87.5±1.29)％，CD3+CD56+細(xì)胞分別為(31.4±1.14)％，(49.0±2.58)％，(63.8±1.98)％;未緩解組CD3+CD8+細(xì)胞分別為(54.0±2.98)％，(71.4±1.82)％，(88.6±3.4)％，CD

11、3+CD56+細(xì)胞分別為(32.4±2.24)％，(50.0±3.2)％，(66.8±4.1)％（見(jiàn)表2）可見(jiàn)，在DC-CIK的培養(yǎng)過(guò)程中，其細(xì)胞免疫表型為CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞比例明顯增高，(p＜0.05)，但兩組DC-CIK間免疫表型的變化不顯著，P值均大于0.05。
　　3緩解組和未緩解組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞殺傷活性比較
　　采集培養(yǎng)15天的DC-CIK細(xì)胞做殺傷實(shí)驗(yàn)，以緩解期和未緩解期來(lái)源的DC-C

12、IK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內(nèi)，比較兩者的殺傷活性。緩解組在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1所對(duì)應(yīng)的殺傷活性結(jié)果為(21.7±4.64)％，(28.9±3.79)％，(42.64±3.25)％，未緩解組取相同的效靶比，相應(yīng)的殺傷活性分別為(30.40±2.73)％，(42.38±3.20)％，(57.49±2.87)％（見(jiàn)表3）。未緩解組來(lái)源的DC-CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞殺傷力略強(qiáng)于緩

13、解組，但經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力的差異不明顯，P值均大于0.05。
　　4未緩解組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)前后白血病細(xì)胞比較
　　細(xì)胞涂片法計(jì)數(shù)未緩解患者外周血中的原始細(xì)胞，培養(yǎng)前平均值為(83±3.1)％，流式測(cè)得CD34+細(xì)胞占(4.23±3.48)％;混合培養(yǎng)一段時(shí)間后再涂片觀察，顯微鏡下未見(jiàn)原始細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)CD34+的細(xì)胞比例降至平均(0.1±0.05)％。比較結(jié)果，培養(yǎng)后的細(xì)胞中原

14、始細(xì)胞較培養(yǎng)前明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P＜0.05。
　　5未緩解組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞殺傷活性的特異性比較
　　收集未緩解組培養(yǎng)的DC-CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以K562細(xì)胞和凍存的患者單個(gè)核細(xì)胞為靶細(xì)胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內(nèi)，比較兩者的殺傷活性。未緩解組在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果為(30.48±2.94)％，(42.66±3.46)％，(57.22±4.23

15、)％，同時(shí)檢測(cè)在相應(yīng)效靶比下，對(duì)凍存的患者的單個(gè)核細(xì)胞的殺傷為(35.23±3.43)％，(47.65±5.92)％，(67.29±7.95)％，（見(jiàn)表4），經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1應(yīng)用未緩解患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，同樣可以培養(yǎng)出DC-CIK細(xì)胞，與緩解組來(lái)源的DC-CIK細(xì)胞比較，增殖活性無(wú)顯著性差異。
　　2未緩解組和緩解組來(lái)源的DC-CIK細(xì)胞中，CD3+CD