髓系白血病干-祖細胞的集落培養(yǎng)及體外分化研究.pdf

1、研究背景及目的：急性髓系白血病(AML)干/祖細胞的研究與造血干細胞(HSC)的研究密不可分。1961年人們提出HSC的概念，開創(chuàng)了干細胞生物學的研究領域，1994年Lapidot等首次通過特異細胞表面標志分離出了人AML的白血病干細胞(LSC)，發(fā)現只有LSC才具有不斷自我更新并維持其惡性顯型的作用，證明了腫瘤干細胞(CSC)的客觀存在。研究表明LSC的特異細胞表型為CD34<'+>/CD38<'->或CD34<'+>/HLA-DR<

2、'->。除急性早幼粒細胞白血病(APL)以外，幾乎所有的AML亞型均與LSC相關。干細胞(SC)具有自我更新及定向分化的特性。上世紀80年代中期我國學者成功使用藥物將APL的原始細胞誘導為成熟細胞，開創(chuàng)了原始白血病細胞分化研究的先河。目前，LSC體外分析方法主要是白血病干/祖細胞集落(CFU-L)形成能力測定法。從SC到祖細胞(PC)及成熟細胞的增殖、分化、凋亡在很大程度上是多種細胞因子通過多種形式的相互作用調控的。 本課題研究

3、的目的為觀察白血病細胞在特定的體外培養(yǎng)條件下，通過加入IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G-CSF等細胞因子誘導髓系白血病干/祖細胞向成熟粒細胞分化。 方法：本實驗分為三部分。 第一部分：包括兩個預實驗，均在相同的CF[J—L培養(yǎng)條件下完成，該培養(yǎng)條件是由Agar、McCoy’5A培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及滋養(yǎng)層細胞(經<'60>CO輻射的正常人外周血白細胞)共同構成的混合體系，簡稱為Agar半固體培養(yǎng)基。

4、 實驗分別為： 1、AML患者骨髓(BM)單個核細胞(MNC)與正常人BM MNC集落生長對照實驗：在上述CFU-L培養(yǎng)條件下，經IL-3、GM-CSF及SCF刺激的AMI，BM MNC與正常人BM MNC進行集落培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第0d、2d、5d及7d對集落計數，進行對照研究。 2、新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC集落生長對照實驗：在相同CFU-L培養(yǎng)條件下，經IL-3、IL-6、SCF、GM

5、-CSF及G-CSF刺激的新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC進行集落培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第0d、2d、5d及7d對集落計數，進行對照研究； 第二部分：髓系白血病干/祖細胞的集落培養(yǎng)實驗： 在IL-3、SCF、GM-CSF等細胞因子的刺激下，AML BM MNC在上述Agar半固體培養(yǎng)基上進行集落培養(yǎng)，并對其進行細胞形態(tài)學和細胞免疫分型的鑒定，以確定其是否為CFU-L。 第三部分：髓系白血病干/祖細

6、胞的體外分化實驗： CFU-L的細胞分別接種于含與不含。FBS的McCoy’s5A培養(yǎng)基中，加入IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G-CSF等細胞因子進行培養(yǎng)，誘導其向成熟粒細胞分化，將培養(yǎng)至20d時收獲的細胞進行細胞形態(tài)學和細胞免疫分型的鑒定，以確定其是否為成熟粒細胞。 結果： 第一部分： 1、顯微鏡觀察：正常人BM MNC在Agar半固體培養(yǎng)基上不形成集落，而AML BM MNC可以在培養(yǎng)第2

7、天時開始出現，到第七天時集落數達到300-500個；統計學方法使用一個重復測量的兩因素設計資料的方差分析，結果顯示兩組集落計數具有明顯統計學差別。 2．顯微鏡觀察：新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC均在培養(yǎng)第2天開始出現集落，第7天集落數量最高；統計學方法與實驗1相同，結果顯示二者在相同培養(yǎng)條件下形成集落計數無明顯統計學差別。 第二部分：CFU-L為白血病干/祖細胞的集落，其細胞形態(tài)學類似小淋巴細胞，

8、無特異表現，不應具有成熟血細胞或常見的白血病細胞的形態(tài)學特點，本實驗收獲的集落細胞的形態(tài)學符合上述特點；CFU-L的細胞免疫分型的特點為CD34<'+>CD38<'->，其粒系分子表面標志CD13<'+>CD15<'+>CD33<'+>的表達低，本實驗收獲的集落細胞CD34<'+>CD38<'->的表達為16.94％±4.52％；CD13<'+>、CD15<'+>及CD3<'+>的表達分別為5.26％±1.92％、6.72％±1.03％

9、及6.77％±3.58％，符合CFU-L的特點。 第三部分：體外分化實驗最終獲得的細胞，在含與不含FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第20天時收獲細胞的平均計數分別為0.98×10<'6>個、90.67×10<'8>個，經成對t檢驗進行統計學分析，存在明顯統計學差別；收獲細胞沒有特殊染色顆粒等成熟粒細胞的形態(tài)學特點，細胞免疫分型的鑒定結果：CD34<'+>CD38<'->、CD13<'+>、CD15<'+>及CD33<'+>表達分別為：0.3

10、0±0.17％、10.73±3.05％、9.67±2.59％及12.35±3.15％，均不符合成熟粒細胞的特點。 結論： 1、在CFU-L的培養(yǎng)條件下，正常人BM MNC不形成集落，可以排除HSC的污染；新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC形成集落的能力無明顯差別，可以用液氮凍存的AML BM MNC樣本做為實驗樣本的補充。 2、經IL-3、SCF、GM-CSF等細胞因子刺激的AML BM MN