JWA基因在人類髓系白血病細(xì)胞定向分化調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、血液細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致了白血病的發(fā)生。目前，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制仍知之甚少。白血病細(xì)胞在一些化學(xué)物誘導(dǎo)下能夠重新返回特定的定向分化路徑。特別是全反式維甲酸(ATRA)在白血病的誘導(dǎo)分化治療方面取得了巨大成功，開創(chuàng)了癌癥治療的嶄新領(lǐng)域——誘導(dǎo)分化療法。JWA(AF070523)基因是本課題組周建偉等首次發(fā)現(xiàn)并克隆的受ATRA誘導(dǎo)的基因。那么，JWA基因是否與ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)有關(guān)呢?為此，本研究將致力于探討JWA基

2、因在人類白血病細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化調(diào)節(jié)中的作用。 目的：探討JWA基因在人類髓系白血病細(xì)胞定向分化調(diào)節(jié)中的作用以及分化誘導(dǎo)劑調(diào)控JWA表達(dá)的機(jī)制，為進(jìn)一步深入了解白血病的發(fā)生、發(fā)展過程并為白血病的預(yù)防、診斷和治療提供新的科學(xué)依據(jù)。 方法：NB4(急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞)、HL-60(急性原始粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞)、U937(單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞)以及K562(慢性粒細(xì)胞性白血病紅白急變細(xì)胞)都是體外研究人類白血病細(xì)胞分化的

3、良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究利用這些細(xì)胞在特定的分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下可向不同方向分化的特性，建立系列體外定向誘導(dǎo)分化模型。細(xì)胞定向分化能力從以下幾方面進(jìn)行評(píng)價(jià)：(1)通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、檢測(cè)NBT還原能力、細(xì)胞表面髓系分化抗原CD11b、CD14表達(dá)來評(píng)價(jià)白血病細(xì)胞髓系方向的分化；(2)通過臺(tái)盤蘭排斥法活細(xì)胞計(jì)數(shù)，或是檢測(cè)細(xì)胞周期來評(píng)價(jià)分化相關(guān)的細(xì)胞生長阻滯情況；(3)采用聯(lián)苯胺染色法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相對(duì)血紅蛋白含量來評(píng)價(jià)細(xì)胞向紅系方向的分化。使用

4、RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)JWA及c-myc、bcl-2等細(xì)胞分化與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。并且利用JWA反義寡核苷酸及RNA干擾技術(shù)下調(diào)和沉默JWA的表達(dá)，以進(jìn)一步探討JWA基因在定向誘導(dǎo)分化中的功能。使用CAT報(bào)告基因分析與Southwestern技術(shù)相結(jié)合的方法，探討分化誘導(dǎo)劑調(diào)控JWA表達(dá)的機(jī)制與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 結(jié)果：(1)1μMATRA、0.1μMTPA和1μMAs2O3分別處理初發(fā)APL原代骨髓或外周血白血

5、病細(xì)胞2天，各組細(xì)胞CD11b表達(dá)的上升和NBT還原能力的增強(qiáng)表明細(xì)胞已出現(xiàn)誘導(dǎo)分化。細(xì)胞周期分析顯示，伴隨著誘導(dǎo)的細(xì)胞分化，細(xì)胞增殖出現(xiàn)了明顯的抑制。同時(shí)，伴隨著上述細(xì)胞分化和增殖抑制，JWA蛋白表達(dá)表現(xiàn)出一致的上調(diào)，提示JWA基因可能參與調(diào)節(jié)分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化的過程。進(jìn)一步探討了JWA基因在不同病期APL中的表達(dá)，初發(fā)病例JWAmRNA的陽性表達(dá)率高于平均水平而完全緩解后表達(dá)陽性率則低于平均水平，這種表達(dá)差異也提示JWA可能與A

6、PL的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 (2)進(jìn)一步利用多種髓系白血病細(xì)胞系建立系列體外定向誘導(dǎo)分化模型：NB4和HL-60細(xì)胞在ATRA的誘導(dǎo)下向粒系分化；NB4和K562細(xì)胞在TPA的誘導(dǎo)下向單核-巨噬系分化；HL-60細(xì)胞還可在Ara-C的誘導(dǎo)下向單核方向分化；K562細(xì)胞還可在Ara-C、hemin和阿霉素的誘導(dǎo)下向紅系方向分化；U937細(xì)胞在ATRA和Ara-C的誘導(dǎo)下向單核-巨噬系方向分化。在這些誘導(dǎo)分化模型中，總體上JWA的表達(dá)均

7、一致性地呈時(shí)間依賴性上調(diào)，提示各種分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化過程中可能存在著共同的信號(hào)通路，而JWA可能與此相關(guān)。 (3)為了解JWA表達(dá)的增加是否為TPA誘導(dǎo)細(xì)胞分化所必須，在TPA誘導(dǎo)NB4和K562細(xì)胞分化之前，先用JWA反義寡核苷酸預(yù)處理以下調(diào)JWA的表達(dá)，再觀察對(duì)細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示反義寡核苷酸在抑制JWA蛋白表達(dá)的同時(shí)部分阻斷了TPA對(duì)NB4和K562細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和增殖抑制作用，提示TPA誘導(dǎo)的NB4和K562

8、細(xì)胞分化是JWA部分依賴性的。 (4)在JWA反義寡核苷酸技術(shù)的基礎(chǔ)上，又采用RNA干涉的方法以進(jìn)一步關(guān)閉JWA基因表達(dá)。結(jié)果顯示SECs介導(dǎo)的RNA干擾能夠有效地抑制JWA表達(dá)。伴隨著JWA基因表達(dá)的沉默，ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化亦被抑制，提示JWA基因表達(dá)的上調(diào)也是ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)所必需的；然而，ATRA誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞分化非但不被抑制反而增強(qiáng)，與ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化過程中JWA表達(dá)下調(diào)的結(jié)

9、果相一致，表明JWA表達(dá)的下調(diào)在ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的過程中是可能必要的。 (5)特別地，HL-60細(xì)胞在ATRA的誘導(dǎo)下呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性地分化增強(qiáng)，JWA的表達(dá)亦呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性地上調(diào)；結(jié)合RNAi沉JWA基因的表達(dá)可抑制ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化與生長抑制的作用，提示JWA可能作為一重要的信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的分化成熟。 (6)為探討聯(lián)合TPA對(duì)ATRA誘導(dǎo)HL-60

10、細(xì)胞分化的影響，考慮到藥物誘導(dǎo)分化的有效性及對(duì)細(xì)胞的毒性作用，我們選用10nMTPA與ATRA序貫聯(lián)合處理HL-60細(xì)胞。結(jié)果表明TPA預(yù)處理可抑制ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化，提示TPA與ATRA兩者參與的信號(hào)通路之間可能存在負(fù)性調(diào)控關(guān)系。TPA預(yù)處理也削弱了ATRA誘導(dǎo)的JWA表達(dá)的上調(diào)，這些結(jié)果進(jìn)一步證明JWA表達(dá)的上調(diào)對(duì)ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化中可能是至關(guān)重要的。 (7)As2O3對(duì)不同濃度ATRA的誘導(dǎo)分化作

11、用有著不同的影響：As2O3(0.5μM，引起部分分化濃度)能夠增強(qiáng)0.01μMATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化和生長抑制作用，而對(duì)0.1μMATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化和生長抑制沒有顯著影響。而且，As2O3與0.01μMATRA聯(lián)合作用的效果與0.1μMATRA單獨(dú)誘導(dǎo)的程度相當(dāng)，提示兩者在低濃度時(shí)在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化方面存在交互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可能是通過上調(diào)JWA的表達(dá)而增強(qiáng)0.01μMATRA的誘導(dǎo)分化作用，這些結(jié)

12、果進(jìn)一步證明JWA表達(dá)的上調(diào)對(duì)ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化可能是必需的。 (8)ATRA不僅誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞定向分化，還誘導(dǎo)了與細(xì)胞終末分化相關(guān)的細(xì)胞凋亡，并且至少是caspase3部分依賴性的。伴隨著HL-60細(xì)胞分化與分化相關(guān)凋亡過程，c-myc、bcl-2兩癌基因的蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低，而JWA的表達(dá)在前6天隨著ATRA處理時(shí)間的延長呈時(shí)間依賴性升高，6天后一直維持在較高水平。利用JWA基因RNAi技術(shù)干預(yù)ATRA

13、處理，發(fā)現(xiàn)伴隨著JWA基因表達(dá)的沉默，ATRA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞分化被抑制的同時(shí)，ATRA誘導(dǎo)c-myc、bcl-2表達(dá)下調(diào)的作用亦被削弱。這些結(jié)果，提示JWA表達(dá)的升高及c-myc、bcl-2表達(dá)的降低在促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生分化的同時(shí)對(duì)終末分化細(xì)胞的凋亡可能具有易化作用，通過凋亡，分化的細(xì)胞得以最終清除；并且在此過程中，JWA可能對(duì)c-myc、bcl-2的表達(dá)起抑制作用，功能上可能類似于一抑癌基因。 (9)為探討HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分

14、化過程中ATRA上調(diào)JWA表達(dá)的機(jī)制，利用JWA基因CAT報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)(-1680PCATwt)，發(fā)現(xiàn)ATRA可調(diào)節(jié)JWA啟動(dòng)子的活性，轉(zhuǎn)錄激活JWAmRNA表達(dá)。為進(jìn)一步確定JWA啟動(dòng)子中介導(dǎo)ATRA反應(yīng)性的序列區(qū)域，構(gòu)建一系列啟動(dòng)子5，端刪除的報(bào)告基因質(zhì)粒并且再次進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)。結(jié)果在進(jìn)一步表明是JWA啟動(dòng)子-194～+107bp區(qū)域的序列介導(dǎo)了對(duì)ATRA的反應(yīng)性。接著，利用Southwestern方法確定結(jié)合到JWA啟動(dòng)子-19

15、4～+107bp序列區(qū)域的核因子，發(fā)現(xiàn)存在于HL-60細(xì)胞未處理組中一條分子量約30kDa的蛋白條帶在ATRA處理組消失了，提示此核因子可能作為一抑制因子參與了調(diào)節(jié)ATRA轉(zhuǎn)錄激活JWA基因啟動(dòng)子活性的機(jī)制。但確切證據(jù)有待進(jìn)一步研究提供。 討論：JWA廣泛參與人類髓系白血病細(xì)胞定向分化的調(diào)節(jié)，可能是多種誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共同的信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)髓系白血病細(xì)胞分化及終末分化相關(guān)凋亡過程中起重要的作用。JWA可能作為

16、人類髓系白血病細(xì)胞分化進(jìn)程與髓系白血病分類的新分子標(biāo)志物。在NB4細(xì)胞向粒系或是單核-巨噬系方向分化的進(jìn)程中，JWA可能作為定向分化方向的限制性基因而參與調(diào)節(jié)。在HL-60細(xì)胞中，ATRA誘導(dǎo)的分化與分化相關(guān)凋亡需要JWA表達(dá)的上調(diào)；而ATRA上調(diào)JWA的表達(dá)是通過激活JWA基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性實(shí)現(xiàn)的。JWA可能受PKC調(diào)節(jié)，參與ATRA與TPA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。JWA還可能對(duì)c-myc、bcl-2的表達(dá)起抑制作用，功能上類