MicroRNA-10b在NPM1突變急性髓系白血病細胞分化阻滯中的作用探討.pdf

1、第一部分探討NPM1基因突變對急性白血病細胞分化的影響
　　 核仁磷酸蛋白基因（nucleophosmin，NPM1）突變在急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關重要的調(diào)控作用，而與白血病分化阻滯的關系尚未闡明。為探討NPM1突變基因?qū)Π籽〖毎w外分化的影響，將攜帶NPM1A型突變（NPM1-mA）的表達質(zhì)粒載體pEGFPC1-NPM1-mA轉染THP-1細胞系，構建穩(wěn)定表達NPM1突變蛋白的細胞株(THP-1 mA)，同時設立野

2、生型NPM1轉染組(THP-1 wt)、空載體轉染組(THP-1 C1)及未處理組(THP-1)為對照。通過RT-PCR、Western blot及免疫細胞化學驗證THP-1 mA細胞株的構建。利用PMA誘導各組細胞分化，瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞分化的形態(tài)改變，計算貼壁細胞率;流式細胞術分析細胞表面分化抗原CD14的表達。結果顯示，成功構建穩(wěn)定表達NPM1突變蛋白的THP-1 mA細胞株。PMA作用72 h后，與對照組相比，THP-1

3、mA組細胞的分化形態(tài)學改變不顯著，貼壁細胞數(shù)明顯降低(P＜0.05);同時，CD14的表達受到顯著抑制(P＜0.01)。提示NPM1突變能夠阻滯白血病細胞系的體外分化。、
　　 第二部分MicroRNA-10b通過調(diào)控鋅指蛋白KLF4阻滯白血病細胞分化
　　 探討microRNA-10b(miR-10b)通過抑制鋅指蛋白Krüppel-likefactor4(KLF4)的表達對急性白血病細胞分化的影響。雙熒光素酶報告基因

4、試驗及Western blot驗證KLF4為has-miR-10b的功能靶基因之一;qPCR及Western blot分別檢測不同分化程度的白血病細胞系中miR-10b與KLF4的表達;1，25-二羥基維生素D3(1，25D3)誘導人白血病細胞系HL60向單核系分化，檢測此過程中miR-10b及KLF4的表達變化;利用體外合成的寡核苷酸(has-miR-10b mimics)轉染HL60細胞，瑞氏-吉姆薩染色觀察1，25D3誘導后細胞分

5、化形態(tài)學的改變，流式細胞術檢測單核細胞表面標志CD14的表達。結果顯示，KLF4為has-miR-10b的功能靶基因;miR-10b在分化早期的KG-1a細胞中表達最高，在分化較晚期的U937、THP-1細胞中表達最低(P＜0.01)，而KLF4的表達與之相反;經(jīng)1，25D3誘導HL60向單核系分化過程中，miR-10b的表達呈時間依賴性降低，KLF4則逐漸增高;HL60細胞中過表達miR-10b后可抑制1，25D3誘導的細胞分化形態(tài)學

6、的改變及CD14的表達(P＜0.05)。提示miR-10b通過負調(diào)控KLF4的表達阻滯白血病細胞HL60向單核系分化。、
　　 第三部分MicroRNA-10b參與阻滯NPM1突變的白血病細胞分化
　　 NPM1突變可引起骨髓增生的異常，然而AML的發(fā)生還須合并其他損傷因素。miRNA調(diào)控作為重要的表觀遺傳學調(diào)控之一，在白血病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。為進一步探討miR-10b失調(diào)是否參與調(diào)控NPMc+AML細胞分化，qPCR

7、及Western blot分別檢測THP-1 mA及OCI/AML3細胞中miR-10b與KLF4的表達;利用體外合成的反義寡核苷酸(has-miR-10b inhibitor)轉染OCI/AML3細胞，檢測KLF4蛋白的表達，流式細胞術檢測單核細胞表面標志CD14的表達情況。結果表明，THP-1 mA細胞中miR-10b表達明顯增高(P＜0.05)，同時KLF4蛋白表達水平下降;在攜帶有NPM1A型突變的白血病細胞系OCI/AML3中