急性髓系白血病患者NPM1突變體特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、本論文包括兩部分內(nèi)容:(一)體外誘導(dǎo)突變型NPM1抗原肽特異性T淋巴細(xì)胞的研究;(二)急性髓系白血病患者突變型NPM1抗原肽特異性T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)。
　　目的：
　　采用負(fù)載突變型NPM1(NPM1mut)抗原肽的樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)體外刺激健康供者自身的淋巴細(xì)胞,以誘導(dǎo)針對(duì)此肽的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答;并且檢測(cè)伴隨NPM1mut急性髓系白血病(NPM1mut+AML)患者的外周血中是否存在NPM1mut抗原肽特異性T淋巴細(xì)胞

2、。以期為白血病患者的免疫治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1. NPM1基因突變檢測(cè):本院初診AML患者常規(guī)行基因突變組套檢測(cè)?；痉椒ㄊ菑幕颊吖撬杌蛲庵苎膯蝹€(gè)核細(xì)胞中提取基因組 DNA,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增NPM1基因的12號(hào)外顯子,直接測(cè)序PCR產(chǎn)物。
　　2.人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)基因分型:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-直接測(cè)序分型法(PCR-SBT)檢測(cè)HLA-A、B、C、DRB1、DQB1五個(gè)基因座位

3、。
　　3.樣本的采集及保存:采集HLA-A*0201或A*1101陽(yáng)性健康供者以及NPM1mut+AML患者緩解期的外周血。Ficoll密度梯度法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),-80℃冰箱凍存24小時(shí)后,放入液態(tài)中凍存。
　　4.CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)及表位肽合成:通過(guò)Net-CTL1.2、Rankpep及SYFPEITHI三種程序軟件預(yù)測(cè)NPM1野生型(NPM1wild)及NPM1mut-A/D的氨基酸序列與HLA

4、-A*0201、A*1101或 A*2402分子結(jié)合的抗原肽。采用固相合成法合成得分最高的表位肽,純度均>95％。
　　5.DCs的培養(yǎng):取密度為3~5×106/ml新鮮或解凍復(fù)蘇的健康供者PBMCs3ml接種于六孔板,采用貼壁法在37℃含5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2h。吸掉上層培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞,貼壁的單核細(xì)胞以含有GM-CSF、IL-4的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)單核細(xì)胞向未成熟DCs分化。培養(yǎng)5天后換用含有GM-CSF、

5、IL-4、IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天,誘導(dǎo)DCs成熟。第7天收集DCs,作為抗原遞呈細(xì)胞(APC)以及進(jìn)行表型鑒定。
　　6.細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化與增殖:DCs分別負(fù)載NPM1野生型及突變型抗原肽后(同時(shí)設(shè)空載組),用γ射線(xiàn)(40Gy)照射處理。然后與解凍復(fù)蘇的自身PBMCs按照細(xì)胞數(shù)1:10的比例加入24孔板中混合培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含有IL-2及IL-7的無(wú)血清培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第7天按上述方

6、法進(jìn)行重復(fù)刺激。
　　7.ELISPOT分析及流式胞內(nèi)染色檢測(cè):混合淋巴細(xì)胞肽培養(yǎng)(MPLCs)的第7、14天采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)以及胞內(nèi)染色的方法檢測(cè)三組淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌。以T2細(xì)胞株作為靶細(xì)胞,設(shè)空白對(duì)照組(未負(fù)載肽組)、負(fù)載野生型表位肽組、負(fù)載突變型表位肽組,比較三組的差異。對(duì)于HLA-A*1101陽(yáng)性的供者,采用自身的DCs作為靶細(xì)胞。AML患者外周血標(biāo)本經(jīng)解凍復(fù)蘇、過(guò)夜休息后進(jìn)行ELISPOT分析。

7、
　　結(jié)果：
　　1.我國(guó)漢族人群中,HLA-A位點(diǎn)中A*1101、A*2402以及A*0201三種等位基因是最為常見(jiàn)的。
　　2.經(jīng)過(guò)上述三種程序軟件預(yù)測(cè)篩選,HLA-A*0201限制性NPM1wild九肽為DLWQWRKSL,NPM1mut-A/D九肽AIQDLCLAV。對(duì)于HLA-A*1101限制性的表位肽,野生型無(wú)合適的表位肽,突變型(A/D)九肽為 AVEEVSLRK。未篩選到合適的HLA-A*2402限制性

8、表位肽。
　　3. DCs培養(yǎng)7天后檢測(cè)其細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量:CD142.6％。CD8043.4％、CD8337.8％、CD8699.9％、HLA-DR67.1％,符合DCs的表型。
　　4. DCs與自身的PBMCs(健康供者)混合培養(yǎng)的第10天左右,淋巴細(xì)胞出現(xiàn)大量增殖,突變型肽組最為顯著。第7天,所有樣本的ELISPOT檢測(cè)結(jié)果均為陰性,陽(yáng)性質(zhì)控孔均正常;第14天,有3例健康供者的ELISPOT突變肽型孔為陽(yáng)性,而野

9、生型肽孔為陰性;此時(shí)突變型肽孔中的NPM1mut抗原肽特異性的T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率[=(突變型肽孔的平均斑點(diǎn)數(shù)-空白對(duì)照孔的平均斑點(diǎn)數(shù))/每孔中加入的淋巴細(xì)胞]平均約為1/2000。胞內(nèi)染色的流式結(jié)果顯示(CD3+CD8+細(xì)胞群設(shè)門(mén)):ELISPOT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的供者于第7、14天突變型肽組CD8+IFN-γ+細(xì)胞的陽(yáng)性率高于空白對(duì)照組,而野生型肽組與空白對(duì)照組無(wú)沒(méi)有明顯差異。
　　5.6例NPM1mut+AML患者的外周血ELISP

10、OT檢測(cè)結(jié)果顯示,只有1例(16.7％)患者樣本的檢測(cè)結(jié)果可疑陽(yáng)性。
　　結(jié)論：
　　健康人中,負(fù)載NPM1mut抗原肽的DCs可以刺激誘導(dǎo)自身的淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生突變型NPM1抗原肽特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答,有望用于AML患者的免疫治療。在NPM1mut+AML患者外周血中,NPM1mut抗原肽特異性T細(xì)胞檢出率低,提示AML患者受化療及疾病本身的影響免疫功能低下缺少應(yīng)答,或許可以考慮來(lái)自親緣供體的細(xì)胞免疫治療。本研究結(jié)果為AML