魚(yú)藤素和冬凌草甲素靶向NPM1突變蛋白——治療NPMc+急性髓系白血病作用機(jī)理研究.pdf

1、第一部分魚(yú)藤素特異性下調(diào)NPM1突變蛋白促進(jìn)NPMc+急性髓系白血病的凋亡及誘導(dǎo)分化
　　目的:核磷蛋白(NPM1)是一種廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)的磷酸蛋白,穿梭于核仁、核質(zhì)和胞漿之間,具有多種生物學(xué)功能。在接近1/3的急性髓系細(xì)胞白血病患者中,NPM1蛋白突變導(dǎo)致NPM1異常的胞漿聚集,是NPMc+AML發(fā)病的重要原因。本實(shí)驗(yàn)主要研究魚(yú)藤素(deguelin)對(duì)急性髓系細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞OCI-AML3(具有NPM1蛋白突變)及

2、OCIM2(NPM1野生型)的細(xì)胞凋亡,細(xì)胞分化,NPM1野生型蛋白,NPM1突變型蛋白的影響,探討其抗腫瘤機(jī)制。
　　方法:采用MTT比色法及臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)魚(yú)藤素作用后AML細(xì)胞OCI-AML3及OCIM2細(xì)胞的增殖及活性;AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;瑞氏-吉姆薩染色,CD11b,CD14分化抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化;分光光度法檢測(cè)Caspase-6和Caspase-8活性;Westernb

3、lot免疫印跡技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP,Caspase3的表達(dá),分化相關(guān)蛋白p53,p21,C/EBPα的表達(dá)以及NPM1總蛋白,野生型及突變型蛋白的表達(dá)水平;siRNA特異性沉默OCI-AML3細(xì)胞NPM1突變蛋白,檢測(cè)OCI-AML3細(xì)胞增殖,細(xì)胞分化及分化相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;
　　結(jié)果:魚(yú)藤素對(duì)NPMc+的AML細(xì)胞OCI-AML3具有明顯抑制作用,可顯著下調(diào)NPM1突變蛋白的表達(dá),而冬凌草甲素,雷公藤內(nèi)酯醇及白樺脂酸對(duì)

4、OCI-AML3NPM1突變蛋白及野生型蛋白表達(dá)均無(wú)影響;在高濃度情況下,魚(yú)藤素可明顯促進(jìn)OCI-AML3細(xì)胞的凋亡,OCI-AML2相對(duì)不敏感,OCI-AML3的凋亡伴隨有Caspase-6,Caspase-8活性上調(diào),NPM-mut蛋白特異性下調(diào);而在低濃度情況下,魚(yú)藤素則可誘導(dǎo)OCI-AML3細(xì)胞分化,對(duì)無(wú)NPM1突變OCIM2細(xì)胞無(wú)此作用,該分化作用可能與Caspase-8活性升高,p53,p21及30kDC/EBPα表達(dá)水平下

5、降有關(guān)。SiNPM-mut沉默OCI-AML3,可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞分化,并可下調(diào)p53,p21及30kDC/EBPα蛋白表達(dá),激活Caspase-8活性。
　　結(jié)論:與NPM1未突變急性白血病相比,OCI-AML3對(duì)魚(yú)藤素最為敏感;高濃度魚(yú)藤素能夠明顯抑制OCI-AML3細(xì)胞的增殖,并能誘導(dǎo)凋亡,這可能與NPM1突變蛋白的表達(dá)下調(diào),Caspase-6,Caspase-8活性上調(diào)有關(guān);而低濃度魚(yú)藤素可特異性誘導(dǎo)OCI-AML3

6、細(xì)胞的分化,該分化作用與NPM1突變蛋白下調(diào),p53,p21及30kDC/EBPα蛋白表達(dá),Caspase-8活性激活有關(guān)。
　　第二部分冬凌草甲素對(duì)NPMc+急性髓系白血病NPM1突變蛋白異常定位的調(diào)節(jié)作用
　　目的:本實(shí)驗(yàn)主要研究冬凌草甲素對(duì)NPMc+AML細(xì)胞OCI-AML3細(xì)胞增殖,細(xì)胞凋亡,核磷蛋白NPM1野生型,突變型蛋白表達(dá)及定位的影響,同時(shí)研究核孔蛋白98及Crm1表達(dá)及定位情況,探討其抗腫瘤機(jī)制。
　

7、　方法:采用MTT比色法檢測(cè)冬凌草甲素作用后NPMc+細(xì)胞OCI-AML3的增殖活性,AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Westernblot免疫印跡技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,PARP蛋白及p14arf、p53的表達(dá),NPM1突變及野生型蛋白,Nup98,Crm1表達(dá)水平和漿核分布情況;RT-PCR分別檢測(cè)Nup98基因水平,免疫熒光共聚焦觀察NPM1突變蛋白、NPM1

8、野生型蛋白和Nup98的亞細(xì)胞定位和表達(dá)。
　　結(jié)果:冬凌草甲素能明顯抑制NPMc+OCI-AML3細(xì)胞的增殖,其抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴性;能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;促進(jìn)NPM1突變蛋白向胞核轉(zhuǎn)位;上調(diào)p14arf及p53的表達(dá);經(jīng)冬凌草甲素干預(yù)后,OCI-AML3細(xì)胞Nup98mRNA及蛋白水平均明顯上調(diào),并伴有明顯的Nup98核內(nèi)轉(zhuǎn)位;冬凌草甲素對(duì)Crm1蛋白表達(dá)無(wú)影響,可使其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位;
　　結(jié)論:冬凌草甲素能夠明顯抑制NPM