白血病血漿循環(huán)DNA完整性和NPM1突變基因定量檢測及其臨床意義.pdf

1、目的：探討白血病患者血漿循環(huán)DNA的總量和完整性及其臨床意義。
　　 方法：提取白血病及各對照組血漿樣本中的循環(huán)DNA，以斑點染色法和實時熒光定量檢測血漿循環(huán)DNA總量。采用瓊脂糖凝膠電泳分析血漿循環(huán)DNA片段的完整性；通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增不同大小的β-actin（ACTB）片段，以β-actin的長短片段之比（ACTB384/106）來定量檢測DNA完整性指標(biāo)；最后觀察了8例急性白血病患者在不同病程中血漿循環(huán)DNA

2、完整性指標(biāo)的動態(tài)改變。
　　 結(jié)果：斑點染色法測定60例急性白血病患者血漿循環(huán)DNA總量為（152.4±242）ng/ml，是健康對照者（19.6±7.9）ng/ml的8倍，同時也高于血液系統(tǒng)良性疾病患者以及實體腫瘤患者組。急性白血病血漿循環(huán)DNA水平與患者的年齡及病程進(jìn)展具有顯著相關(guān)性，而不同型別的急性白血病患者血漿循環(huán)DNA含量則未見顯著性差異。實時熒光定量檢測血漿反映DNA總量的中位數(shù)為8.80 ng/ml，顯著高于對照組

3、中位數(shù)3.42ng/ml，以此為基礎(chǔ)檢測白血病患者血漿循環(huán)DNA水平的ROC曲線下面積（AUC）為0.79。
　　 急性白血病血漿循環(huán)DNA電泳呈大小不一的片段，同時血漿循環(huán)DNA中可擴(kuò)增出ACTB的大小片段產(chǎn)物，DNA完整性程度較高。DNA完整性指標(biāo)的ROC曲線AUC為O.88。8例急性白血病患者的配對樣本中DNA完整性指標(biāo)在完全緩解時有明顯減少，而在第一次復(fù)發(fā)時DNA完整性指標(biāo)再次升高。
　　 結(jié)論：急性白血病血漿循

4、環(huán)DNA含量和完整性指標(biāo)明顯增高，且與患者的臨床特征和病程進(jìn)展明顯相關(guān)，可作為新型血漿檢驗指標(biāo)用于急性白血病的監(jiān)測。
　　 目的：構(gòu)建pMD18-T-NPM1A重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立實時熒光定量檢測急性髓系白血?。ˋML）患者血漿NPM1突變基因的方法并探討其臨床意義。
　　 方法：提取AML患者外周血漿和血細(xì)胞DNA，擴(kuò)增NPM1A型突變基因（NPM1A）片段，并克隆）KT-A載體構(gòu)建pMDl8-T-NPM1A重組質(zhì)粒，

5、用PCR。和測序鑒定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。設(shè)計針對NPM1A的引物，探討最佳反應(yīng)條件，建立實時熒光定量PCR檢測NPM1A的方法，并進(jìn)行方法學(xué)評價（包括靈敏度、特異性、重復(fù)性、線性范圍）。將本法初步用于臨床樣本檢測，觀察AML患者NPM1A水平的改變。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-NPM1A，經(jīng)PCR和測序鑒定與預(yù)期結(jié)果一致，符合定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品要求。實時熒光定量PCR法的最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec，95℃變性

6、5sec，60℃退火30sec；最適反應(yīng)體系為：總體積25μl，其中SYBR Premix Ex Faq（2×）12.5μl、正義、反義引物（10pmol/ul）均為O.5μl，待測標(biāo)本（臨床標(biāo)本，陽性標(biāo)準(zhǔn)模板，陰性對照和陽性對照）2μl、ddHt2O8μl。該法線性范圍較寬（104～1012copies/ml），靈敏度高（102copies/ml）、特異性好，重復(fù)性好（批內(nèi)CV值為3.21％；天間CV值為4.87％）。血漿循環(huán)DNA中