魚藤素靶向Mt NPM1-SIRT1軸——誘導(dǎo)NPMc+急性髓系白血病細(xì)胞分化機(jī)理的研究.pdf

1、目的：核磷蛋白（NPM1），是一種低聚核仁磷酸蛋白，定位于核仁，穿梭于核漿之間，在維持核仁結(jié)構(gòu)，DNA修復(fù)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，組蛋白伴侶活性等起著重要的作用。NPM1高表達(dá)于增殖活躍的細(xì)胞如干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，其突變導(dǎo)致NPM1蛋白C末端氨基酸肽的改變，減弱了核定位信號，使NPM1異常胞漿定位，帶動(dòng)和NPM1相互作用的蛋白或轉(zhuǎn)錄因子也異常定位于胞漿，造成細(xì)胞生物學(xué)功能的紊亂，引發(fā)癌癥發(fā)生和進(jìn)展。NPM1基因突變發(fā)生在約60％核型正常的急性髓系白血

2、病患者，是AML中檢出率最高的分子學(xué)異常，成為NPMc+AML發(fā)病的重要因素。盡管造血干細(xì)胞移植聯(lián)合化療的改進(jìn)極大促進(jìn)了AML的治療，然而仍不能治愈。然而誘導(dǎo)分化治療的策略改變了某些AML亞型的結(jié)局，如亞砷酸，維甲酸治療AML-M3（具有PML-RARα融合基因），明顯提高了緩解率和疾病生存期。白血病的誘導(dǎo)分化治療亦成為研究熱點(diǎn)。因此，研發(fā)高效且副作用小的藥物是急性髓系白血病治療的另一有效途徑。魚藤素是我們課題組先后承擔(dān)兩項(xiàng)國家自然科學(xué)

3、基金面上項(xiàng)目基礎(chǔ)上篩選出的具有調(diào)控白血病細(xì)胞核孔蛋白及核磷蛋白表達(dá)和功能的天然單體藥物，我們首次發(fā)現(xiàn)高劑量魚藤素能活化凋亡信號通路，誘導(dǎo)NPMc+AML細(xì)胞凋亡，低劑量時(shí)，誘導(dǎo)分化，然而其促分化機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了有關(guān)研究。
　　方法：以NPMc+AML體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型OCI-AML3細(xì)胞（攜帶突變NPM1蛋白）為研究對象，以O(shè)CIM2細(xì)胞作為陰性對照（攜帶野生型NPM1），采用MTT，LDH釋放實(shí)驗(yàn)及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測魚

4、藤素干預(yù)后的細(xì)胞增殖抑制率及活性改變。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞表面分化標(biāo)記（CD11b/CD14/CSF-3R）的表達(dá)。瑞氏-吉姆薩染色檢測分化細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；硝基四氮唑藍(lán)（NBT）還原試驗(yàn)檢測具有還原活性的分化細(xì)胞比例；Western blot蛋白免疫印跡技術(shù)及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測Mt NPM1，Wt NPM1，HDAC1，HDAC3，SIRT1，C/EBPβ及G-CSFR的蛋白及mRNA表達(dá)水平；免疫蛋白共沉淀技術(shù)（IP）

5、檢測Mt NPM1泛素化水平改變；20S酶活性試劑盒檢測魚藤素處理后細(xì)胞20S蛋白酶活性；慢病毒si-RNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)沉默Mt NPM1及SIRT1后，探索Mt NPM1和SIRT1的關(guān)系，檢測C/EBPβ及G-CSFR的蛋白及mRNA表達(dá)水平；構(gòu)建慢病毒Mt NPM1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染OCI-AML3細(xì)胞后，檢測魚藤素干預(yù)后細(xì)胞表面分化抗原及分化蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：魚藤素以濃度依賴方式抑制了NPM1突變細(xì)胞系OCI-

6、AML3細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，而對NPM1野生型細(xì)胞系OCIM2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用不明顯；魚藤素在非毒性劑量（2μM）/長時(shí)間（5d）作用下，誘導(dǎo)OCI-AML3細(xì)胞分化，而對OCIM2細(xì)胞無促分化作用。非毒性劑量魚藤素顯著下調(diào)Mt NPM1，SIRT1，HDAC1，HDAC3的表達(dá)，上調(diào)C/EBPβ及G-CSFR的蛋白及mRNA表達(dá)，而不影響Wt NPM1蛋白表達(dá)。魚藤素通過泛素蛋白酶體途徑降低Mt NPM1水平，而在翻譯后水平誘導(dǎo)SIR

7、T1的下調(diào)。si-NPM Mut干預(yù)OCI-AML3細(xì)胞后，可下調(diào)SIRT1蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞分化，同時(shí)也上調(diào)C/EBPβ及G-CSFR的蛋白表達(dá)，而不改變HDAC1/HDAC3水平；而si-SIRT1干預(yù)OCI-AML3細(xì)胞后，沒有改變Mt NPM1蛋白水平，但促分化效應(yīng)和si-NPM Mut干預(yù)類似，說明Mt NPM1下調(diào)引起的促分化效應(yīng)部分和SIRT1的下調(diào)相關(guān)；最后，同轉(zhuǎn)染對照慢病毒相比，Mt NPM1過表達(dá)于OCI-AML3細(xì)