白細胞介素21增強CIK細胞抗白血病作用的研究.pdf

1、目的:
　　 研究白細胞介素21(IL-21)對外周血來源CIK細胞（細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞）抗白血病的作用及其作用機制。
　　 方法:
　　 1、采集分離正常人的外周血單個核細胞，加用細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細胞。
　　 2、構(gòu)建表達IL-21基因的慢病毒載體，感染CIK細胞并鑒定。
　　 3、MTT法檢測外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細胞的增殖能力及殺傷白血病細胞系K562細胞作用。
　　

2、 4、流式細胞儀檢測外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細胞免疫表型及其表面IL-21受體(IL-21R)、FasL、細胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶B的表達。
　　 5、半定量RT-PCR法檢測外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細胞IFN-γ、TNF-α、TNF-β、穿孔素、顆粒酶A、顆粒酶B、FasL和NKG2D mRNA的表達。
　　 6、酶聯(lián)免疫法檢測外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的表達。<

3、br>　　 7、Western blot法檢測外源IL-21作用下CIK細胞JAK-STAT信號途徑的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、在外源IL-21作用下:
　　 (1)總的細胞數(shù)量的擴增無明顯變化，CIK細胞的產(chǎn)生由（17.5±4.7）％升至(26.5±2.1)％(p＜0.05)。
　　 (2) CIK細胞對K562細胞的殺傷作用由(22.8±2.8)％升至(44.6±8.3)％。(p＜0.05)<

4、br>　　 (3) CIK細胞表面IL-21R的表達增加約2倍。
　　 (4) CIK細胞IFN-γ mRNA的表達升高了經(jīng)2倍由0.3760±0.2358升至0.7786±0.2493(p＜0.05)，TNF-α mRNA的表達升高約2倍由0.6557±0.1598升至1.3145±0.2136(p＜0.05)，穿孔素mRNA的表達升高了約1.5倍由0.6361±0.1457升至0.9831±0.1265(p＜0.05)，顆

5、粒酶B mRNA的表達量升高了近2倍由0.4084±0.1589升至0.7319±0.1639(p＜0.05)，F(xiàn)asLmRNA的表達升高了約2倍由0.4015±0.2842升至0.7381±0.2568(p＜0.05)，顆粒酶A、TNF-β和NKG2D mRNA的表達與對照相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (5)對mRNA表達有差異的指標進一步行蛋白表達的檢測發(fā)現(xiàn):CIK細胞表面FasL的表達水平加IL-21組(0.19％)與未加

6、IL-21組(0.04％)有明顯差異，CIK細胞內(nèi)穿孔素的表達由35.28％升至53.16％，顆粒酶B的表達由43.16％升至78.82％，培養(yǎng)上清中IFN-γ的表達由(25.8±6.1) ng/L升至(56.0±2.3)ng/L(p＜0.05)，TNF-α的表達由(5.64±0.61)μg/L升至(15.14±0.93)μg/L(p＜0.05)。
　　 (6) Western blot結(jié)果顯示STAT1和STAT5a的表達無明

7、顯差異，STAT3和STAT5b的表達增加。
　　 2、在內(nèi)源IL-21作用下:經(jīng)酶切與測序鑒定，IL-21慢病毒載體構(gòu)建正確，共轉(zhuǎn)染CIK細胞中有目的基因IL-21的表達。與對照相比:
　　 (1)總的細胞數(shù)量的擴增無明顯變化，CIK細胞的產(chǎn)生由（16.95±4.7）％升至(24.60±2.1)％(p＜0.05)。
　　 (2) CIK細胞對K562細胞的殺傷作用由（23.28±2.8）％升至（58.42±8.

8、3）％(p＜0.05)，作用5天后仍能維持在（61.16±6.2）％(p＜0.05)，相比外源作用由（22.80±2.8）％升至（44.60±8.3）％(p＜0.05)，殺傷作用更強，而且作用時間更長久。
　　 (3) CIK細胞表面IL-21R的表達增加約2倍。
　　 (4) CIK細胞IFN-γ和TNF-αmRNA的表達升高了1.5倍多，穿孔素、顆粒酶B、FasL mRNA的表達量升高了近2倍，顆粒酶A、TNF-β和

9、NKG2D mRNA的表達與對照無明顯差別。
　　 (5)對mRNA表達有差異的指標進一步行蛋白表達的檢測發(fā)現(xiàn):CIK細胞表面FasL的表達水平轉(zhuǎn)染IL-21組(0.56％)與對照組(0.06％)有明顯差異，CIK細胞內(nèi)穿孔素的表達由12.23％升至25.86％，顆粒酶B的表達由14.56％升至37.58％，IFN-γ的表達由（23.2±5.6）ng/L升至（55.3±3.5）ng/L(p＜0.05)，TNF-α的表達由（5.6

10、5±0.58）μg/L升至（15.62±0.62）μg/L(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 IL-21具有增強CIK細胞抗白血病的作用，IL-21與IL-2具有協(xié)同作用，而且內(nèi)源作用下作用時間更長久，此作用是通過增加其受體的表達，增加穿孔素、顆粒酶B、FasL、IFN-γ和TNF-α的表達而實現(xiàn)的。JAK-STAT細胞信號途徑的激活是此種作用的機制之一。提示IL-21在增強白血病免疫治療中具有潛在的臨床應(yīng)用前景。<