白細(xì)胞介素-27促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖及殺傷功能實驗研究.pdf

1、目的:初步探討重組人白細(xì)胞介素-27（interleukin-27，IL-27）體外對人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine induced killer, CIK)細(xì)胞增殖及其對腫瘤細(xì)胞殺傷功能影響，并探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.無菌條件下抗凝抽取健康志愿者外周血20ml，采用Ficoll密度梯度離心法分離人

2、外周血單個核細(xì)胞，第0天加入IFN-γ(1000 U/ml)，隨后根據(jù)加入不同細(xì)胞因子劑量隨機(jī)分為六組進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)，分別為:A組(IL-2:1000 U/ml),B組（IL-2:1000 U/ml,IL-27:20 ng/ml），C組(IL-2:1000 U/ml, IL-27:10 ng/ml),D組(IL-2:500 U/ml, IL-27:10ng/ml),E組（IL-2:500 U/ml,IL-27:20 ng/ml），F(xiàn)

3、組(IL-27:20 ng/ml),均種植于抗CD3-抗體（CD3-antibody，CD3-Ab）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）包被的培養(yǎng)瓶中，2-3天視細(xì)胞生長情況傳代擴(kuò)增，同時根據(jù)上述濃度補加細(xì)胞因子IL-2和IL-27。
　　2.倒置相差顯微鏡下觀察各組CIK細(xì)胞生長情況及形態(tài)學(xué)變化。
　　3.通過全自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)培養(yǎng)3、5、7、9、11、13天各組CIK細(xì)胞數(shù)量，分析各組CIK細(xì)胞增殖情況。

4、r>　　4.通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測培養(yǎng)7、9、11、13天各組CIK細(xì)胞CD3+CD56+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平。
　　5.通過MTS方法測定各組CIK細(xì)胞對淋巴瘤K562細(xì)胞殺傷活性。
　　6.通過RT-PCR方法檢測各組CIK細(xì)胞干擾素-γ(interference-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α) mRNA的表達(dá)水平。

5、
　　結(jié)果:
　　1.通過倒置相差顯微鏡下觀察到:各組CIK細(xì)胞培養(yǎng)第3-5天，細(xì)胞體積變大，部分細(xì)胞呈梭形生長，各組CIK細(xì)胞未見明顯差異。培養(yǎng)第7天左右，A組、B組、C組和D組CIK細(xì)胞分布密集，體積變大，部分細(xì)胞呈集落樣生長;E組和F組CIK細(xì)胞與A組相比，細(xì)胞數(shù)量較少，部分細(xì)胞體積變小。培養(yǎng)11天左右，A組、B組、C組和D組CIK細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞透明度明顯增加，多呈集落樣懸浮生長;E組和F組CIK細(xì)胞與A組相比

6、細(xì)胞縮小、變圓，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　2.全自動細(xì)胞計數(shù)儀分別計數(shù)培養(yǎng)3、5、7、9、11、13天各組CIK細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示:A組CIK細(xì)胞培養(yǎng)13天達(dá)增殖高峰，增殖倍數(shù)為(3257.73±91.97)，B組、C組、D組、E組和F組CIK細(xì)胞培養(yǎng)11天增殖倍數(shù)達(dá)峰值，分別為(3790.92±64.49，4009.85±43.08，4811.87±23.07，2017.31±35.24和1812.78±29.18)。D組CIK細(xì)

7、胞培養(yǎng)11天增殖倍數(shù)較正常對照組A組培養(yǎng)13天增殖倍數(shù)顯著性增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與B組、C組、E組和F組CIK細(xì)胞培養(yǎng)11天相比，D組CIK細(xì)胞增殖可見明顯差異(P＜0.05)。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:通過組內(nèi)比較，A組CIK細(xì)胞CD3+CD56+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)13天表達(dá)率最高，分別為(60.03±1.75)％和(62.71±0.69)％，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CD3

8、+CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)11天和13天表達(dá)率分別為(95.2±1.89)％和(91.6±2.57)％，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與培養(yǎng)7天及9天相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。B組CIK細(xì)胞CD3+CD56+T細(xì)胞培養(yǎng)9天表達(dá)率為(55.51±0.03)％，培養(yǎng)11天CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)率為(74.92±2.47)％，均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。CD3+CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)13天表達(dá)率為(93.30±1.91)％

9、，與11天比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，與培養(yǎng)7天及9天相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。C組CIK細(xì)胞CD3+CD56+T細(xì)胞培養(yǎng)11天表達(dá)率為(56.07±0.83)％，CD3+CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)13天表達(dá)率為（74.43±1.90）％，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CD3+CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)11天和13天表達(dá)率分別為(95.50±1.83)％和(95.50±2.93)％，兩者之間不具有統(tǒng)計學(xué)差異，與培養(yǎng)7天和9天比較具有

10、統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。D組CIK細(xì)胞培養(yǎng)11天時CD3+CD56+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)率明顯較高，分別為(66.57±2.44)％和(81.67±1.97)％，均具有顯著性差異(P＜0.05)，CD3+CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)11天和13天表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，分別為(97.80±1.44)％和(95.70±1.56)％，與7天和9天相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　通過組間比較發(fā)現(xiàn)，D組CIK細(xì)胞培養(yǎng)11天C

11、D3+CD56+T細(xì)胞表達(dá)與正常對照組A組培養(yǎng)13天，B組培養(yǎng)9天及C組培養(yǎng)11天相比均具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，CD3+CD4+T細(xì)胞表達(dá)與A組培養(yǎng)11天，B組培養(yǎng)13天及C組培養(yǎng)11天相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)與A組和B組培養(yǎng)11天，C組培養(yǎng)13天相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.MTS殺傷實驗結(jié)果顯示，效靶比為10∶1、20∶1、40∶1時，D組CIK細(xì)胞培養(yǎng)11天時殺傷

12、率最高，分別為（57.23±5.74）％，（65.27±3.27）％和（76.71±2.21）％，與正常對照組A組CIK細(xì)胞培養(yǎng)13天殺傷結(jié)果相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與B組和C組CIK細(xì)胞培養(yǎng)11天殺傷結(jié)果相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　5.RT-PCR結(jié)果顯示，A組、B組、C組和D組CIK細(xì)胞培養(yǎng)11天IFN-γ和TNF-α mRNA的表達(dá)水平分別為(0.45±0.09，2.77±0.20，2.77±0.

13、16,3.36±0.19)和(0.44±0.08,3.13±0.16,3.09±0.12,3.94±0.73)，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)B組、C組和D組CIK細(xì)胞IFN-γ和TNF-αmRNA的表達(dá)水平與正常對照組A組比較均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，D組CIK細(xì)胞IFN-γ和TNF-α mRNA的表達(dá)水平與B組及C組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.細(xì)胞因子IL-27與IL-2聯(lián)合應(yīng)用體外可