白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)衰老成纖維細(xì)胞促進(jìn)角膜新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 本試驗(yàn)擬研究IL-1β對(duì)正常和衰老角膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)和基因表達(dá)的影響，以及IL-1β處理后正常和衰老成纖維細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管能力上的差別，同時(shí)體內(nèi)觀察正常和衰老的成纖維細(xì)胞，以及經(jīng)IL-1β處理后的正常和衰老成纖維細(xì)胞影響角膜新生血管生長(zhǎng)方面的區(qū)別。
　　 方法：
　　 1.人角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞（human comeal fibroblasts，HCF）原代及傳代培養(yǎng):供體人角膜取自

2、于眼球捐獻(xiàn)者，無菌條件下，采用消化法原代培養(yǎng)人角膜成纖維細(xì)胞，4～5代內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:應(yīng)用300μMH2O2誘導(dǎo)人角膜成纖維細(xì)胞衰老，10ng/mlIL-1β處理正常和衰老的成纖維細(xì)胞。衰老成纖維細(xì)胞采用衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)。
　　 細(xì)胞分為以下四組。正常對(duì)照組（A組）:正常人角膜成纖維細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);衰老角膜成纖維細(xì)胞組（B組）:H2O2誘導(dǎo)人角膜成纖維細(xì)胞衰老;IL-1β組（C組）:IL-

3、1β處理正常角膜成纖維細(xì)胞;IL-1β處理的衰老角膜成纖維細(xì)胞組（D組）:IL-1β處理衰老角膜成纖維細(xì)胞。
　　 3.Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞新生血管相關(guān)因子MMPs、VEGF、PEDF、tPA、uPA等的表達(dá)。收集四組細(xì)胞條件培養(yǎng)液，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVECs)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，采用MTT比色法測(cè)定不同成纖維細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能

4、力的影響，Transwell法測(cè)定其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響，Matrigel成管實(shí)驗(yàn)評(píng)估其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的影響。
　　 4.體內(nèi)試驗(yàn)應(yīng)用C57/BL6小鼠，分為A、B、C、D四組，左眼為手術(shù)眼，行角膜基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞注射，右眼為對(duì)照眼，A組注射正常角膜成纖維細(xì)胞，B組注射衰老角膜成纖維細(xì)胞，C組注射IL-1β誘導(dǎo)的正常角膜成纖維細(xì)胞，D組注射IL-1β誘導(dǎo)的衰老角膜成纖維細(xì)胞，并于術(shù)后3天、5天、7天、10、14天裂隙燈

5、觀察眼前節(jié)情況并照相，觀察記錄角膜新生血管形成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.人角膜基質(zhì)細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)
　　 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)角膜緣組織消化接種2～3天后可見少許細(xì)胞爬出，呈梭形排列整齊，4～5天后，相鄰細(xì)胞連接向周圍生長(zhǎng)，1周后融合，傳代培養(yǎng)2周后，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。
　　 2.處理后四組角膜成纖維細(xì)胞光鏡下觀察:B組衰老角膜成纖維細(xì)胞形態(tài)較A組正常成纖維細(xì)胞體積變大，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，

6、SA-β-gal染色陽性;C組和D組由IL-1β處理正常和衰老的角膜成纖維細(xì)胞，前者細(xì)胞較正常略有增大，細(xì)胞連接緊密;后者細(xì)胞增大增寬，排列疏松，胞漿顆粒增多，有雙核現(xiàn)象。
　　 3.Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞新生血管相關(guān)因子MMPs、VEGF、tPA、uPA、uPAR等的表達(dá)，B、C、D組均明顯高于A組(P＜0.05)，PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1、COL4A1，B、C、D組明顯低于A組（P＜0.05

7、）;D組與B組比較，MMP1、MMP2、MMP3、MMP13、tPA、uPA顯著升高（P＜0.05），PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1明顯下降（P＜0.05）;D組與C組比較，MMP1、MMP2、MMP3顯著升高(P＜0.05），PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1明顯下降(P＜0.05)。B、C、D組HUVECs的增殖、遷移、成管數(shù)量明顯高于A組(P＜0.05);D組遷移、成管數(shù)量明顯高于B、C組(P＜0.05)，但增

8、殖活性的提高不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.裂隙燈觀察小鼠術(shù)后角膜新生血管情況，A組術(shù)后3天角膜緣血管擴(kuò)張充血，7天時(shí)無新生血管長(zhǎng)入角膜;B、C組術(shù)后3天角膜緣血管擴(kuò)張充血，7天時(shí)新生血管開始向注射區(qū)域生長(zhǎng)，10天時(shí)長(zhǎng)入注射區(qū)域;D組術(shù)后3天注射區(qū)域角膜緣有新生血管長(zhǎng)入，7天時(shí)有大量新生血管向注射區(qū)域生長(zhǎng)，10天時(shí)大量新生血管長(zhǎng)入注射區(qū)域。
　　 結(jié)論：
　　 1.衰老的角膜成纖維細(xì)胞能夠顯著上調(diào)新

9、生血管促進(jìn)因子VEGF和MMP的表達(dá)，并能顯著下調(diào)新生血管抑制因子PEDF、TSP1和TSP2的表達(dá)水平。
　　 2.IL-1β誘導(dǎo)的衰老成纖維細(xì)胞比正常細(xì)胞和衰老細(xì)胞更能夠顯著上調(diào)新生血管促進(jìn)因子VEGF和MMP的表達(dá)，并能顯著下調(diào)新生血管抑制因子PEDF、TSP1和TSP2的表達(dá)水平。
　　 3.IL-1β誘導(dǎo)的衰老成纖維細(xì)胞比正常細(xì)胞和衰老細(xì)胞在體外更能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管能力，體內(nèi)更易誘導(dǎo)角膜新生血管