皮膚真皮衰老相關(guān)microRNA表達譜分析及其在衰老成纖維細胞中的驗證研究.pdf

1、研究背景：皮膚衰老是機體衰老的重要外在表現(xiàn)。皮膚衰老不僅有損于美容，也可導(dǎo)致許多年齡相關(guān)性疾病，而給人帶來身心損害。由于皮膚真皮包含多種類型的細胞及縱橫交錯的細胞外基質(zhì)成分，因而在皮膚衰老過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。目前有關(guān)真皮衰老的機制研究涉及了表觀遺傳學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等多種分子生物學(xué)層面，然而microRNA (miRNA)與真皮衰老之間的關(guān)系尚不明確。miRNA是一類短鏈單鏈RNA，通過與靶基因3'端的非編碼區(qū)序列特異性相結(jié)合從而

2、發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。miRNA可在多個層面影響機體的生理病理過程。了解真皮衰老相關(guān)miRNA的表達特點及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于進一步加深對真皮衰老的認識，為后續(xù)抗衰老研究提供新的思路。
　　研究目的：1.初步了解真皮衰老進程中的miRNA差異表達譜，探討該差異表達譜對應(yīng)靶基因可能涉及的基因功能和調(diào)控通路，建立miRNA與部分衰老相關(guān)靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。2.探索該差異表達的miRNA在年輕和衰老成纖維細胞中的變化情況，比較其與組織結(jié)果之間的

3、一致性和差異性，并探討這些miRNA可能參與的細胞衰老調(diào)控通路。
　　研究方法：在第一部分中，本研究選取12例源于非曝光部位的真皮樣本，包括6例年輕真皮組織和6例衰老真皮組織，利用miRNA芯片初步篩選出衰老和年輕真皮差異表達的miRNA，運用實時定量RT-PCR驗證部分miRNA表達情況。繼而利用miRNA對應(yīng)靶基因進行功能聚類分析和信號通路聚類分析，構(gòu)建miRNA與可能涉及衰老調(diào)控的靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并得到網(wǎng)絡(luò)中起核心調(diào)控

4、作用的miRNA。在第二部分中，本研究將原代真皮成纖維細胞分別培養(yǎng)于正常營養(yǎng)和低營養(yǎng)培養(yǎng)基中并進行連續(xù)細胞傳代，對各自營養(yǎng)狀態(tài)下傳代早期細胞與傳代后期細胞進行多種衰老標記的比較，包括利用細胞計數(shù)法比較了細胞增殖曲線，利用SA-β-GA染色法比較了衰老細胞比例，運用實時定量RT-PCR方法比較了衰老相關(guān)標記基因的mRNA表達量。最后通過實時定量RT-PCR方法比較了部分真皮衰老相關(guān)miRNA在衰老代和年輕代成纖維細胞之間的變化情況。

5、>　　研究結(jié)果：1.miRNA芯片結(jié)果分析顯示，隨著皮膚真皮衰老，真皮組織中共有40個miRNA差異性表達。2.實時定量RT-PCR顯示衰老組織內(nèi)miR-34家族及miR-29家族表達顯著增加，與芯片結(jié)果具有一致性。3.靶基因功能聚類和通路聚類分析發(fā)現(xiàn)，miRNA對應(yīng)靶基因的主要功能聚類包括細胞間粘附作用、膠原合成作用、基因轉(zhuǎn)錄的正性及負性調(diào)控作用等，主要通路聚類包括代謝調(diào)節(jié)通路、生長因子通路和細胞外基質(zhì)與受體調(diào)控通路、DNA損傷反應(yīng)通

6、路等。4.miRNA-Gene-Network分析顯示miR-34家族、miR-29家族和miR-424在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占有較大權(quán)重5.無論在正常營養(yǎng)培養(yǎng)條件抑或低營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，相較于早期傳代細胞而言，傳代至后期時細胞的增殖能力均明顯下降，SA-β-GA陽性細胞比例顯著上升，p16基因的mRNA表達水平顯著上調(diào)，而p53及p21基因的mRNA水平未見明顯變化。6.miRNA實時定量結(jié)果顯示，無論何種營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，篩選出的11個miRNA

7、（即miR-548q、miR-1226*、miR-601、miR-1207-5p、miR-134、miR-34b*、miR-34a、miR-29c*、miR-181a、miR-154、miR-424）在衰老代細胞中均呈現(xiàn)出上調(diào)表達的趨勢，其中絕大多數(shù)變化趨勢與組織miRNA芯片結(jié)果相一致，但miR-181a、miR-154和miR-424在衰老細胞內(nèi)的變化趨勢與芯片結(jié)果之間存在矛盾。7.miRNA上調(diào)變化程度在各自營養(yǎng)培養(yǎng)條件下傳代的衰

8、老細胞中有所不同，正常營養(yǎng)條件下衰老代細胞以miR-34家族和miR-29家族上調(diào)最為顯著，而低營養(yǎng)培養(yǎng)條件下衰老代細胞以miR-1226*、miR-601及miR-1207-5p上調(diào)為劇，miR-29家族未見明顯上調(diào)。8.實時定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低營養(yǎng)培養(yǎng)條件下的衰老代細胞內(nèi)，miRNA部分靶基因如E2F3、c-Myc、CREB在mRNA水平上尚存在表達下降。
　　研究結(jié)論：真皮衰老進程中存在miRNA的差異性表達，差異表

9、達miRNA的靶基因主要參與細胞粘附、膠原合成、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，主要涉及代謝通路、生長因子通路、細胞外基質(zhì)與受體相互作用及DNA損傷反應(yīng)通路等，且miR-34家族、miR-29家族及miR-424可能在真皮衰老過程中有較為重要的調(diào)控作用。在體外成纖維細胞的衰老模型中可觀察到與真皮衰老進程大致相似的miRNA變化情況，但個別miRNA顯示出的矛盾結(jié)果提示miRNA可能參與到除成纖維細胞衰老以外的真皮衰老的機制中，如炎癥反應(yīng)、血管新生異常等