皮膚真皮衰老相關(guān)microRNA表達(dá)譜分析及其在衰老成纖維細(xì)胞中的驗(yàn)證研究.pdf

1、研究背景：皮膚衰老是機(jī)體衰老的重要外在表現(xiàn)。皮膚衰老不僅有損于美容，也可導(dǎo)致許多年齡相關(guān)性疾病，而給人帶來身心損害。由于皮膚真皮包含多種類型的細(xì)胞及縱橫交錯的細(xì)胞外基質(zhì)成分，因而在皮膚衰老過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。目前有關(guān)真皮衰老的機(jī)制研究涉及了表觀遺傳學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等多種分子生物學(xué)層面，然而microRNA (miRNA)與真皮衰老之間的關(guān)系尚不明確。miRNA是一類短鏈單鏈RNA，通過與靶基因3'端的非編碼區(qū)序列特異性相結(jié)合從而

2、發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。miRNA可在多個層面影響機(jī)體的生理病理過程。了解真皮衰老相關(guān)miRNA的表達(dá)特點(diǎn)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于進(jìn)一步加深對真皮衰老的認(rèn)識，為后續(xù)抗衰老研究提供新的思路。
　　研究目的：1.初步了解真皮衰老進(jìn)程中的miRNA差異表達(dá)譜，探討該差異表達(dá)譜對應(yīng)靶基因可能涉及的基因功能和調(diào)控通路，建立miRNA與部分衰老相關(guān)靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。2.探索該差異表達(dá)的miRNA在年輕和衰老成纖維細(xì)胞中的變化情況，比較其與組織結(jié)果之間的

3、一致性和差異性，并探討這些miRNA可能參與的細(xì)胞衰老調(diào)控通路。
　　研究方法：在第一部分中，本研究選取12例源于非曝光部位的真皮樣本，包括6例年輕真皮組織和6例衰老真皮組織，利用miRNA芯片初步篩選出衰老和年輕真皮差異表達(dá)的miRNA，運(yùn)用實(shí)時定量RT-PCR驗(yàn)證部分miRNA表達(dá)情況。繼而利用miRNA對應(yīng)靶基因進(jìn)行功能聚類分析和信號通路聚類分析，構(gòu)建miRNA與可能涉及衰老調(diào)控的靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并得到網(wǎng)絡(luò)中起核心調(diào)控

4、作用的miRNA。在第二部分中，本研究將原代真皮成纖維細(xì)胞分別培養(yǎng)于正常營養(yǎng)和低營養(yǎng)培養(yǎng)基中并進(jìn)行連續(xù)細(xì)胞傳代，對各自營養(yǎng)狀態(tài)下傳代早期細(xì)胞與傳代后期細(xì)胞進(jìn)行多種衰老標(biāo)記的比較，包括利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法比較了細(xì)胞增殖曲線，利用SA-β-GA染色法比較了衰老細(xì)胞比例，運(yùn)用實(shí)時定量RT-PCR方法比較了衰老相關(guān)標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)量。最后通過實(shí)時定量RT-PCR方法比較了部分真皮衰老相關(guān)miRNA在衰老代和年輕代成纖維細(xì)胞之間的變化情況。

5、>　　研究結(jié)果：1.miRNA芯片結(jié)果分析顯示，隨著皮膚真皮衰老，真皮組織中共有40個miRNA差異性表達(dá)。2.實(shí)時定量RT-PCR顯示衰老組織內(nèi)miR-34家族及miR-29家族表達(dá)顯著增加，與芯片結(jié)果具有一致性。3.靶基因功能聚類和通路聚類分析發(fā)現(xiàn)，miRNA對應(yīng)靶基因的主要功能聚類包括細(xì)胞間粘附作用、膠原合成作用、基因轉(zhuǎn)錄的正性及負(fù)性調(diào)控作用等，主要通路聚類包括代謝調(diào)節(jié)通路、生長因子通路和細(xì)胞外基質(zhì)與受體調(diào)控通路、DNA損傷反應(yīng)通

6、路等。4.miRNA-Gene-Network分析顯示miR-34家族、miR-29家族和miR-424在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占有較大權(quán)重5.無論在正常營養(yǎng)培養(yǎng)條件抑或低營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，相較于早期傳代細(xì)胞而言，傳代至后期時細(xì)胞的增殖能力均明顯下降，SA-β-GA陽性細(xì)胞比例顯著上升，p16基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而p53及p21基因的mRNA水平未見明顯變化。6.miRNA實(shí)時定量結(jié)果顯示，無論何種營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，篩選出的11個miRNA

7、（即miR-548q、miR-1226*、miR-601、miR-1207-5p、miR-134、miR-34b*、miR-34a、miR-29c*、miR-181a、miR-154、miR-424）在衰老代細(xì)胞中均呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢，其中絕大多數(shù)變化趨勢與組織miRNA芯片結(jié)果相一致，但miR-181a、miR-154和miR-424在衰老細(xì)胞內(nèi)的變化趨勢與芯片結(jié)果之間存在矛盾。7.miRNA上調(diào)變化程度在各自營養(yǎng)培養(yǎng)條件下傳代的衰

8、老細(xì)胞中有所不同，正常營養(yǎng)條件下衰老代細(xì)胞以miR-34家族和miR-29家族上調(diào)最為顯著，而低營養(yǎng)培養(yǎng)條件下衰老代細(xì)胞以miR-1226*、miR-601及miR-1207-5p上調(diào)為劇，miR-29家族未見明顯上調(diào)。8.實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低營養(yǎng)培養(yǎng)條件下的衰老代細(xì)胞內(nèi)，miRNA部分靶基因如E2F3、c-Myc、CREB在mRNA水平上尚存在表達(dá)下降。
　　研究結(jié)論：真皮衰老進(jìn)程中存在miRNA的差異性表達(dá)，差異表

9、達(dá)miRNA的靶基因主要參與細(xì)胞粘附、膠原合成、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，主要涉及代謝通路、生長因子通路、細(xì)胞外基質(zhì)與受體相互作用及DNA損傷反應(yīng)通路等，且miR-34家族、miR-29家族及miR-424可能在真皮衰老過程中有較為重要的調(diào)控作用。在體外成纖維細(xì)胞的衰老模型中可觀察到與真皮衰老進(jìn)程大致相似的miRNA變化情況，但個別miRNA顯示出的矛盾結(jié)果提示miRNA可能參與到除成纖維細(xì)胞衰老以外的真皮衰老的機(jī)制中，如炎癥反應(yīng)、血管新生異常等