EGCG對(duì)SIRT6基因介導(dǎo)的抗皮膚成纖維細(xì)胞衰老的研究.pdf

1、[目的]：
　　研究表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate，EGCG)對(duì)中波紫外線(xiàn)(ultraviolet radiation B，UVB)作用下人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性及凋亡的影響，以及去乙?；?（sirtuins6，SIRT6）基因和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclearfactor-κB，NF-κB)表達(dá)水平的變化，探討EGCG抗皮膚衰老的機(jī)理，為EGCG在臨床上應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)

2、。
　　[方法]：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:取正常皮膚組織在(37℃，5％CO2)條件下，含10％胎牛血清培養(yǎng)基培育細(xì)胞，采用蘇木素和波形蛋白染色法鑒定皮膚成纖維細(xì)胞。
　　2.實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和、EGCG1-4組(25μmol/ml、50μmol/ml、75μmol/ml、100μmol/ml)和UVB1-4組（30mJ/cm2、60 mJ/cm2、90mJ/cm2、120mJ/cm2），根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給予細(xì)胞不同劑

3、量UVB照射，并預(yù)先加入不同濃度EGCG培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，篩選最佳UVB照射劑量和最適EGCG濃度。
　　3.實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、EGCG組、UVB組、UVB+EGCG組，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞凝膠電泳等方法研究UVB和EGCG處理皮膚成纖維細(xì)胞后的增殖、凋亡以及細(xì)胞內(nèi)活性氧和DNA損傷的影響;采用Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)和qRT-PCR法檢測(cè)NF-κB mRNA表達(dá)情況。

4、r>　　[結(jié)果]：
　　1.皮膚成纖維細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示:蘇木素染色胞核胞質(zhì)呈淡藍(lán)色;波形蛋白免疫組織化學(xué)染色顯示波形蛋白染色胞質(zhì)呈棕黃色。
　　2.MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1) EGCG對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響:EGCG1和EGCG2分別與空白白對(duì)照組相比OD490值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），EGCG3和EGCG4組與空白對(duì)照組相比OD490值降低（P＜0.05）。
　　(2) UVB對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響:同對(duì)照組

5、相比UVB1-4組OD490值均降低(P＜0.05);故在以下實(shí)驗(yàn)取最低UVB有效劑量30mJ/cm2。
　　(3) EGCG有效濃度分析:EGCG1+UVB組和EGCG2+UVB組分別與UVB組相比OD490值明顯升高(P＜0.05); EGCG2+UVB組與EGCG1+UVB組相比OD490值升高(P＜0.05）; EGCG3+UVB組與UVB組OD490值相比降低(P＞0.05); EGCG4+UVB組與UVB組相比OD49

6、0值降低(P＜0.05)。故后面實(shí)驗(yàn)選取EGCG濃度為50μM。
　　3.細(xì)胞周期與凋亡實(shí)驗(yàn)顯示:同空白對(duì)照組相比，UVB組細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)明顯降低(P＜0.05);同UVB組相比，EGCG+UVB組PI明顯升高(P＜0.05);UVB組細(xì)胞平均凋亡率達(dá)48.56％，EGCG處理后細(xì)胞凋亡率平均降低15.67％。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性氧(ROS)結(jié)果顯示:同空白對(duì)照組相比，EGCG組細(xì)胞ROS明顯降低(P＜0.

7、05); UVB組細(xì)胞ROS顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05);同UVB組相比，EGCG+UVB組細(xì)胞ROS明顯降低(P＜0.05)。
　　5.qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示:同空白對(duì)照組相比，EGCG組SIRT6蛋白表達(dá)量明顯升高(P＜0.01);EGCG+UVB組與UVB組相比SIRT6蛋白表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)。同空白對(duì)照組相比，UVB組NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);而E

8、GCG+UVB組與同UVB組相比NF-B mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。
　　6.彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:UVB組彗尾DNA率、尾長(zhǎng)、Olive尾距分別與空白對(duì)照組和EGCG組相比有顯著差異(P＜0.01)，EGCG+UVB組彗尾DNA率、尾長(zhǎng)、Olive尾距等各項(xiàng)指標(biāo)與UVB組相比明顯減小(P＜0.01)。
　　[結(jié)論]：
　　1.UVB以劑量依賴(lài)的方式抑制人皮膚成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，同時(shí)EGCG能減輕UV