人皮膚成纖維細(xì)胞攪拌培養(yǎng)和保存的初步研究.pdf

1、目的：利用磁力攪拌培養(yǎng)器微載體攪拌培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況；檢測(cè)細(xì)胞增殖達(dá)到平臺(tái)期后不同保存條件下細(xì)胞的活力及保存時(shí)間；觀察攪拌培養(yǎng)微載體上細(xì)胞接種到普通培養(yǎng)瓶中移行、增殖和分泌Ⅰ型膠原含量的情況；觀察攪拌培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞用于制備復(fù)方殼多糖人工皮膚后的增殖情況及細(xì)胞形態(tài)。
　　 方法：利用酶消化法分別培養(yǎng)出人包皮成纖維細(xì)胞和包皮表皮細(xì)胞，選取6～10代的人皮膚成纖維細(xì)胞(細(xì)胞量為8×106，密度為4×1

2、04/ml)接種到濃度為2.5g/L的微載體cytodex-3攪拌培養(yǎng)瓶中，用200ml改良培養(yǎng)基按20rpm/min，連續(xù)攪拌50min，暫停5min，循環(huán)模式進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，以靜態(tài)培養(yǎng)為對(duì)照，利用CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)兩種方法培養(yǎng)每隔24h后細(xì)胞各自的增殖情況，倒置相差顯微鏡定時(shí)觀察和掃描電鏡選時(shí)相點(diǎn)觀察細(xì)胞形態(tài)并照相；檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)增殖達(dá)到平臺(tái)期后的保存時(shí)間和MTT法檢測(cè)在室溫和4℃保存條件下細(xì)胞混懸液的OD值，據(jù)此計(jì)算出活細(xì)胞量制作

3、活細(xì)胞量曲線；在攪拌培養(yǎng)第9天取微載體成纖維細(xì)胞混懸液15ml進(jìn)行移行培養(yǎng)觀察，并做細(xì)胞爬片的vimentin免疫組化染色鑒定人皮膚成纖維細(xì)胞；用ELISA方法測(cè)定移入方瓶培養(yǎng)后培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原的含量；按我科方法制備復(fù)方殼多糖組織工程皮膚，對(duì)比觀察攪拌培養(yǎng)和普通培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞植入復(fù)方殼多糖組織工程皮膚后的增殖情況，進(jìn)行HE染色觀察。
　　 結(jié)果：人皮膚成纖維細(xì)胞接種在微載體上攪拌培養(yǎng)具有正常的形態(tài)，與靜態(tài)培養(yǎng)比較，需要的微載體

4、量少(2.5g/L)，以此微載體濃度進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞總產(chǎn)量與接種量之間呈數(shù)量級(jí)擴(kuò)增，大多數(shù)微載體上能長(zhǎng)滿成纖維細(xì)胞，且需要的培養(yǎng)基量少(每瓶200ml改良培養(yǎng)基)，能快速大規(guī)模擴(kuò)增，從接種增殖到達(dá)平臺(tái)期只需10～12天，且收獲細(xì)胞量是接種量的5倍左右；在攪拌培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞達(dá)到增殖平臺(tái)期后，室溫和4℃條件下在微載體上保存的細(xì)胞活力比靜態(tài)培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞保存的時(shí)間長(zhǎng)，室溫條件下能保存三周左右，在第3天時(shí)保存的細(xì)胞活力有較

5、大一過性降低，隨后又逐漸恢復(fù)，活力在第19天時(shí)最佳，可達(dá)到86.96％，到第23天時(shí)細(xì)胞活力明顯下降只有64.36％，而4℃條件下相應(yīng)保存的細(xì)胞活力到第19天時(shí)只有13.04％，細(xì)胞活力下降明顯，均低于室溫保存的細(xì)胞；攪拌培養(yǎng)后第9天移入方瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞具有正常形態(tài)和增殖特性，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)液測(cè)定Ⅰ型膠原含量結(jié)果顯示，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，Ⅰ型膠原含量前5天隨時(shí)間的推移和細(xì)胞的增殖而分泌增加；觀察混合成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)方殼多糖組織