細(xì)胞自噬在UVA致人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 UVA對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:提取、培養(yǎng)、鑒定原代人皮膚成纖維細(xì)胞，獲得足夠的細(xì)胞源。從形態(tài)學(xué)觀察不同劑量長(zhǎng)波紫外線(UVA)對(duì)原代人皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，分析照射后成纖維細(xì)胞增殖活性隨UVA劑量變化的關(guān)系，探討UVA對(duì)原代人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響以及摸索UVA誘導(dǎo)原代人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的最佳劑量與時(shí)間。
　　方法:1.收集2-14歲男性包皮環(huán)切術(shù)后的包

2、皮，消毒后，將包皮分離，取真皮層;剪碎成糜狀，加入膠原酶消化，離心后棄上清，用完全培養(yǎng)基（含87％高糖DMEM、10％ FBS、1％GlutaMAX、1％NEAA、1％青霉素-鏈霉素溶液）重懸后，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定，獲得了高純度的細(xì)胞源。進(jìn)行不斷的傳代，凍存細(xì)胞。直接計(jì)數(shù)法觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。2.建立UVA照射成纖維細(xì)胞模型，觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞以1.5×105 cells/ml密度均勻地接種

3、于6孔板中，待細(xì)胞融合度為80％時(shí)于SUV-1000日光紫外線模擬器光束下進(jìn)行照光，設(shè)有未照光的對(duì)照組、4 J/cm2組、8 J/cm2組、12 J/cm2組、16 J/cm2組、20 J/cm2組、40 J/cm2組、80 J/cm2組，照射后細(xì)胞繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察不同的時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)變化，并照相記錄。3.不同劑量UVA照射后，設(shè)有5組:對(duì)照組、4J/cm2組、8 J/cm2組、12 J/cm2組、16 J/cm2

4、組，每種劑量設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4h加入20ul MTT,150ul DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm下檢測(cè)各孔吸光度OD值。4.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)設(shè)置有5組:對(duì)照組、4 J/cm2組、8 J/cm2組、12 J/cm2組、16 J/cm2組。UVA照光后培養(yǎng)4h，加入BindingBuffer、5ul AnnexinⅤ-FITC和5ul PI在流式細(xì)胞儀下進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:1.人皮膚成纖維細(xì)胞1-2天貼壁生長(zhǎng)，呈紡錘形或

5、者梭形，細(xì)胞鑒定發(fā)現(xiàn)波形蛋白染色為陽(yáng)性，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的原代細(xì)胞符合人皮膚成纖維細(xì)胞的特征。直接計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)第3-5天細(xì)胞增殖速度較快，處于對(duì)數(shù)期;第6-7天細(xì)胞融合度達(dá)80％，生長(zhǎng)速度緩慢，處于平臺(tái)期。2.隨著UVA劑量的增加，UVA對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的損傷增大，呈劑量依賴關(guān)系:照射劑量越大，胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞排列間隙增大，胞質(zhì)折光性下降。UVA照射成纖維細(xì)胞后4h的細(xì)胞形態(tài)變化較大。3.照射劑量≥8 J/cm2，隨著照射劑量的

6、增加細(xì)胞增殖活性下降，與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01);除對(duì)照組與4J/cm2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組之間有顯著差異（F=219.01，P＜0.01）。當(dāng)UVA的劑量為8 J/cm2時(shí)，細(xì)胞增殖活性大于85％且細(xì)胞狀態(tài)良好。4.隨著UVA照射劑量的增加，成纖維細(xì)胞凋亡率逐漸增加。除對(duì)照組與4 J/cm2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),12 J/cm2組與16 J/cm2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

7、，其余各組之間具有顯著差異（F=106.61, P＜0.01）。照射劑量≥8 J/cm2，與對(duì)照組相比，有顯著性差異（P＜0.01）。
　　結(jié)論:1.UVA照射可導(dǎo)致原代人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，呈劑量依賴性。2.UVA照射原代人皮膚成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性受到抑制，UVA劑量越大，活性下降越明顯。3.UVA可誘導(dǎo)原代人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率隨UVA強(qiáng)度的增大而升高。
　　第二部分 細(xì)胞自噬對(duì)UVA致人皮膚成纖

8、維細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:觀察自噬誘導(dǎo)劑RAPA和抑制劑3-MA對(duì)UVA照射原代人皮膚成纖維細(xì)胞后細(xì)胞活性的改變;明確UVA照射后，自噬與UVA致成纖維細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　方法:1.實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、RAPA組、3-MA組。照光前加入100 nmol/L RAPA和50 umol/L3-MA預(yù)先孵育2h,8 J/cm2UVA照射成纖維細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)4h，觀察細(xì)胞形態(tài)。2.將細(xì)胞接種在96孔板上，每孔約5000個(gè)細(xì)胞。RAP

9、A組、對(duì)照組、3-MA組，每種劑量設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，2天后將96孔板置于紫外線模擬器下照光，培養(yǎng)4h后用MTT法檢測(cè)上述三組的細(xì)胞活性。3.按照第一部分類似的方法用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述三組細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:1.形態(tài)學(xué)觀察各組成纖維細(xì)胞形態(tài):RAPA組最好，對(duì)照組次之，3-MA組最差。2.干預(yù)后，細(xì)胞活性從高到低的順序依次是RAPA組、對(duì)照組、3-MA組;RAPA組和3-MA組分別與對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;組間