低劑量UVA誘導人皮膚成纖維細胞出現(xiàn)適應性反應中自噬的變化觀察.pdf

1、近年來，紫外線與人皮膚健康的關系一直是研究的熱點。紫外線是把“雙刃劍”，一方面，紫外線一直被認為是皮膚的殺手，除了可能導致各種光敏性皮膚病，過多的紫外線照射也是造成皮膚光老化及暴露部位皮膚癌多發(fā)的最重要因素;另一方面，紫外線也存在有益的生物學效應，接受適當?shù)淖贤饩€照射可以提高機體免疫力，預防某些自身免疫性疾病，促進骨骼的生長發(fā)育，減少腫瘤的發(fā)生。這些有益的生物效應可能與其低劑量照射誘導的興奮效應存在一致的關系。適應性反應是輻射興奮效應的

2、重要內(nèi)容。我們前期實驗已證實低劑量的長波紫外線(UVA)輻射可以誘導培養(yǎng)皮膚細胞出現(xiàn)適應性反應[1]，這種適應性反應表現(xiàn)為單次或多次低劑量UVA預照射能減輕隨后致死劑量UVA照射對培養(yǎng)皮膚成纖維細胞形態(tài)學上的毒性反應，并使細胞凋亡的比例下降、DNA鏈斷裂減少及修復加快，但這種適應性反應的機制仍有待進一步闡明。自噬(autophagy)是真核細胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，是將細胞內(nèi)變形、衰老或損傷的蛋白質(zhì)和細胞器轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中消化降解的一種

3、代謝過程。自噬有利于為此細胞和組織的動態(tài)平衡，是維持真核細胞內(nèi)環(huán)境的自我穩(wěn)定并實現(xiàn)更新的一種有效途徑，也是其適應環(huán)境變化的一種重要的防御機制，但低劑量UVA照射誘導的適應性反應與自噬之間的相關性目前仍末見報道。本文觀察了低劑量UVA誘導人皮膚成纖維細胞適應性反應中自噬的變化，探討其在誘導培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞適應性反應的可能作用，為全面闡明低劑量UVA誘導人皮膚細胞適應性反應的機制提供更多的實驗依據(jù)。
　　目的:
　　1.觀察

4、低劑量長波紫外線誘導人皮膚成纖維細胞出現(xiàn)適應性反應中自噬的形態(tài)及數(shù)量的變化，對比不同組細胞的自噬形態(tài)及數(shù)量的差異。
　　2.通過檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin1來探討低劑量UVA誘導人皮膚成纖維細胞適應性反應中自噬的可能機制。
　　3.探討自噬在誘導培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞適應性反應的可能作用。
　　方法:
　　1.取18歲健康男性陰莖包皮環(huán)切術后包皮（取自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科門診手術室）采用組織消化法培

5、養(yǎng)人皮膚成纖維細胞。
　　2.分組:
　　假照射組:為正常的培養(yǎng)細胞，與照射組同樣處理后置于照射裝置下進行假照射;
　　低劑量照射組:(1)低劑量照射A組:每天以單次劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J/cm2、28.8 J/cm2、36 J/cm2照射進行照射;(2)低劑量照射B組:每天以劑量為7.2 J/cm2進行照射，累積劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J

6、/cm2、28.8J/cm2、36 J/cm2。
　　高劑量照射組:(1)高劑量照射A組:每天以單次劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J/cm2、28.8 J/cm2、36 J/cm2照射后，隨后以86.4J/cm2UVA照射細胞。(2)高劑量照射B組:每天為先以累積劑量分別為7.2 J/cm2、14.4 J/cm2、21.6 J/cm2、28.8 J/cm2、36 J/cm2低劑量UVA預照射后，再以

7、86.4J/cm2UVA照射細胞。
　　3.運用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察MDC染色后各組細胞內(nèi)自噬形態(tài)及數(shù)量的變化，對比不同組細胞的自噬形態(tài)及數(shù)量的差異;利用流式細胞術檢測各組自噬相關蛋白LC3、Beclin1自噬陽性表達百分比。
　　4.統(tǒng)計學方法:用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差((x)±s)。方差齊性檢驗后，進行雙因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　

8、結(jié)果:
　　1.組織消化法培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞24h內(nèi)貼壁，剛開始貼壁時細胞多數(shù)呈圓形，隨貼壁時間延長逐漸伸展成梭形或多邊形。5-6天進行傳代，傳代后約5天長滿。取第3-10代人皮膚成纖維細胞進行實驗研究。
　　2.采用激光共聚焦顯微鏡觀察，假照射組的細胞自噬體陽性表達率在1d、2d、3d、4d、5d時分別為4.333±0.577、4.333±1.528、5.000±1.155、7.000±1.000、5.333±1.15

9、5，假照射組組內(nèi)的細胞自噬體陽性表達率無顯著差異(P＞0.05);低劑量照射A組的細胞自噬體陽性表達率在1d、2d、3d、4d、5d時分別為13.677±1.528、37.333±1.528、57.333±2.082、79.333±1.528、36.330±1.528，與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);低劑量照射B組的細胞自噬體陽性表達率在1d、2d、3d、4d、5d時分別為13.677±1.284、32.000±2.000、

10、46.677±1.528、57.000±2.000、30.000±1.000,與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);低劑量照射A組和低劑量照射B組的細胞自噬體陽性表達率均隨著照射劑量的增加而增加，但在28.8 J/cm2后細胞自噬體陽性表達率出現(xiàn)減少，低劑量照射A組細胞自噬體陽性表達率比低劑量照射B組高，低劑量照射A組與低劑量照射B組相比較有顯著差異(P＜0.01)。高劑量照射A組的細胞自噬體陽性表達率在1d、2d、3d、4d、5

11、d時分別為29.360±2.020、80.130±3.096、45.140±1.845、19.630±0.772、7.537±0.463，與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);高劑量照射B組的細胞自噬體陽性表達率在1d、2d、3d、4d、5d時分別為29.360±2.020、35.850±1.513、56.100±1.365、76.000±1.579、31.440±1.662，與假照射組相比較有顯著差異(P＜0.01);高劑量照射

12、A組在14.4 J/cm2接受86.4J/cm2照射后，細胞自噬體陽性表達率出現(xiàn)減少，高劑量照射B組細胞自噬體陽性表達率在28.8 J/cm2接受86.4J/cm2照射后出現(xiàn)減少，高劑量照射A組與高劑量照射B組相較有顯著差異(P＜0.01)。
　　3.與細胞自噬體陽性表達率檢測結(jié)果相一致，低劑量照射A組和低劑量照射B組的Beclin1、LC3表達均隨著照射劑量的增加而升高，但在28.8 J/cm2后Beclin1、LC3表達水平下

13、降，低劑量照射A組Beclin1、LC3表達水平均比低劑量照射B組高，低劑量照射A組與低劑量照射B組相比較有顯著差異(P＜0.01);高劑量照射A組與高劑量照射B組相比，高劑量照射A組Beclin1、LC3表達很快達到高峰值然后迅速下調(diào)，而高劑量照射B組Beclin1、LC3表達仍能慢慢隨著劑量的累積而增加高峰值才出現(xiàn)下調(diào)。高劑量照射A組與高劑量照射B組相比較有顯著差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.低劑量UVA照射