EGCG抑制UVB及UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞MMP-1水平及其相關(guān)分子機制的實驗研究.pdf

1、研究背景： 太陽光中的紫外線(UV)輻射是一種非常顯著的環(huán)境因子，它主要作用于人的皮膚。根據(jù)波長大小，太陽光中的紫外線可以分為三類：1)長波紫外線(UVA)，波長為320～400mm，是長波紫外線，幾乎全部到達(dá)地面，能穿透真皮；2)中波紫外線(UVB)，波長為280～320nm，可以穿透皮膚，大部分可到達(dá)地面；3)短波紫外線(UVC)，波長為200～280nm，均被臭氧層所吸收，不能到達(dá)地面。UVA主要作用于真皮，其深度可達(dá)真皮

2、中部，成纖維細(xì)胞是其作用的主要靶部位，UVB部分可達(dá)真皮淺層，成纖維細(xì)胞是其靶部位之一。 日光中的UVA和UVB除對皮膚癌有啟動和促進(jìn)作用外，更重要的是紫外線輻射極易促進(jìn)皮膚老化過程。真皮膠原結(jié)構(gòu)改變?yōu)楣饫匣匾獧C理之一。光老化在真皮表現(xiàn)為真皮膠原降解增多，彈力纖維變性，從而產(chǎn)生皺紋和皮膚彈性減小。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的一類重要的蛋白水解酶類，通過水解、破壞及重組ECM，最終導(dǎo)致皮膚結(jié)締組織結(jié)構(gòu)重

3、建，引起皮膚老化的臨床表現(xiàn)。絲裂素活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)是一種序列極端保守的蘇氨酸和絲氨酸雙位磷酸化的酶系，在氧化、紫外線、神經(jīng)遞質(zhì)及激素等多種不同應(yīng)激介導(dǎo)因素下將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，通過精細(xì)調(diào)節(jié)、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯和新陳代謝等，為細(xì)胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一。近年來發(fā)現(xiàn)c-Jun氨基端激酶(JNK)為MAPK通路的關(guān)鍵分子之一，參與了皮膚光老化的信號轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)過程。JNK和p38被磷酸化后最終啟動轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白(AP)1。AP1為MMPs轉(zhuǎn)錄所必需，從而促使MMPs高表達(dá)。通過特異性抑制JNK磷酸化過程，可抑制MAPKs信號通路參與的光老化、炎癥反應(yīng)、凋亡及增殖過程。表沒食子兒茶素沒食子酸(epigallocatechingallate，EGCG)是茶多酚的主要活性成分(50％)，有抗突變、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。國內(nèi)外研究已證實綠荼提取物活性成份EGCG可

5、抑制UV照射導(dǎo)致的皮膚水腫、松弛及增厚，具有光保護(hù)作用。本項目旨在研究和對比UVB及UVA照射對培養(yǎng)狀態(tài)下人皮膚成纖維細(xì)胞(FB)表達(dá)MMP-1 mRNA及蛋白水平的影響，并以JNK特異性抑制荊SP600125為陽性參照探討EGCG的光保護(hù)作用機制與MAPK信號通路的相關(guān)性，籍此可為綠茶及其提取物作為天然防曬劑應(yīng)用于對UVA及UVB兩種波長紫外線的防護(hù)開發(fā)提供理論證明和實驗數(shù)據(jù)參考。 目的： 觀察UVA及UVB照射對培養(yǎng)

6、狀態(tài)下人皮膚成纖維細(xì)胞(FB)MMP-1mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響以及加入EGCG或信號蛋白JNK特異性抑制劑的干預(yù)作用；觀察UVB照射對培養(yǎng)狀態(tài)下人皮膚成纖維細(xì)胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表達(dá)的影響以加入EGCG或信號蛋白JNK特異性抑制劑的干預(yù)作用，籍此探討EGCG抑制Uv誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞MMP-1分泌作用及其對相關(guān)調(diào)控分子影響，可為天然防曬劑的開發(fā)和實際應(yīng)用提供理論依據(jù)扣實驗數(shù)據(jù)參考。 方法： 　　

7、1.細(xì)胞培養(yǎng)：分離獲得漢族青年包皮環(huán)切術(shù)后皮膚成纖維細(xì)胞(FB)，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 106/ml，根據(jù)實驗?zāi)康牟煌謩e定量接種在6孔板以及96孔板中，細(xì)胞80％融合時照射中波紫外線(UVB)。 2.紫外線照射：根據(jù)實驗設(shè)計定時定量進(jìn)行UVB或UVA照射，于照射前后加入相關(guān)藥物進(jìn)行干預(yù)處理。 3.細(xì)胞活性檢測：MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。 4.MM

8、P-1蛋白水平檢測：ELISA法檢測MMP-1蛋白水平。 5.MMP-1mRNA表達(dá)檢測：RT-PCR法檢測MMP-1mRNA表達(dá)。 6.JNK蛋白磷酸化水平檢測：Western blotting法檢測磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1.EGCG或SP600125干預(yù)對UVB或UVA照射誘導(dǎo)MMP-1分泌水平的影響。單純EGCG或SP600125處理FB后各組間MMP-1分泌無差異(P＞0.

9、05)。單純UVB或UVA照射組較未照射不加藥組MMP-1分泌顯著增加，前兩者分別為后者的3.10倍及1.82倍(P<0.05)。UVB照射前后加EGCG或SP600125使MMP-1分泌減少，該兩組MMP-1分泌水平分別為單純UVB照射組的61.8％及48.9％(P<0.05)。與此類似，UVA照射前后加EGCG或SP600125也使MMP-1分泌減少，該兩組MMP-1分泌水平分別為單純UVA照射組的66.7％及70.9％(P<0.0

10、5)。 2.UVB或UVA對FB MMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時效性影響。UVB照射FB后12h及24hMMP-1mRNA表達(dá)較正常對照組顯著增加(P<0.05)，分別為未照射組的2.60倍及2.66倍。 UVA照射FB后24hMMP-1mRNA表達(dá)增加，為未照射組的1.98倍(P<0.05)。 3.EGCG或SP600125對UVB或UVA照射誘導(dǎo)MMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響。單純UVB照射組MMP-1mRNA

11、轉(zhuǎn)錄表達(dá)較非照光的三組顯著增加，EGCG/SP600125處理的UVB兩組較單純UVB照射組均顯著抑制MMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)(P<0.05)，該兩組灰度分別為單純照射組的71.9％及40.4％。單純UVA照射組MMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)較非照光的三組顯著增加，EGCG/SP600125處理的UVA兩組較單純UVA照射組均顯著抑制MMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)(P<0.05)，該兩組灰度分別為單純照射組的62.2％及68.3％。非

12、照射UVA或UVB照射的三組間MMP-1mRNA表達(dá)無差異(P>0.05)。 4.UVB照射FB后p-JNK表達(dá)的時效性及EGCG對UVB照射誘導(dǎo)p-JNK蛋白表達(dá)水平的影響。p-JNK蛋白于UVB照射后1/2h表達(dá)增加，于照射后6h開始下降。單純UVB照射組p-JNK表達(dá)較非照光的三組顯著增加，其中單純UVB照射組與正常對照組的灰度比值為1.68，EGCG/SP600125處理的UVB的兩組較單純UVB照射組p-JNK水平表達(dá)

13、降低(P<0.05)，該兩組灰度分別為單純UVB照射組的27.9％7&32.4％。非UVB照射的三組間p-JNK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0。05)。 結(jié)論： UVB或UVA照射成纖維細(xì)胞后MMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白分泌水平均顯著增加，且趨勢相同，但就量效及時效作用而言UVB的光損傷作用強于UVA。EGCG或SP600125可同時抑制UVB及UVA誘導(dǎo)的MMP-1蛋白分泌及mRNA轉(zhuǎn)錄水平。p-JNK蛋白于UVB