AGEs對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1和MMP-8的作用.pdf

1、目的：本研究將體外合成的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)與人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts，HGFs)共培養(yǎng)，觀察AGEs對(duì)HGFs增殖及表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix matello proteinase-1，MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-8(matrix matello proteinase-8，MMP-8)的影響，探討AGEs

2、加重糖尿病性牙周炎的可能機(jī)制。
　　 方法：①采用酶消化一組織塊法進(jìn)行HGFs原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。取第3代HGFs繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)并用SABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色以鑒定細(xì)胞來(lái)源。體外合成晚期糖基化終末產(chǎn)物修飾的人血清白蛋白(advanced glycation endproducts-modified human serum albumin，AGE-HSA)。將制備好的AGE-HSA用熒光光譜法進(jìn)行鑒

3、定，同時(shí)測(cè)定其內(nèi)毒素的含量。以含2％FBS的DMEM稀釋成實(shí)驗(yàn)所需不同濃度。②取第4代生長(zhǎng)良好的HGFs，胰酶消化后以5×104個(gè)/ml等量接種于96孔板。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至相互融合時(shí)，分別與0、0.5、5、50、100、200μg/mlAGE-HSA及50μg/mlHSA共培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第24、48、72h，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況并計(jì)算細(xì)胞抑制率。③取第4代生長(zhǎng)良好的HGFs，胰酶消化后以5×104個(gè)/ml等量接種于96孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞

4、長(zhǎng)至相互融合時(shí)，分別加入0、0.5、5、50、100μg/mlAGE-HSA及50μg/mlHSA共培養(yǎng)24、48、72h后，收集各組細(xì)胞上清液，3000r/min，20min以去除細(xì)胞殘?jiān)?，酶?lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)中MMP-1及MMP-8的蛋白水平；提取各組細(xì)胞的總RNA，實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative reve

5、rse transcription-polymerase chain reaction，RTQ-PCR)測(cè)定MMP-1及MMP-8的RNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：①HGFs最早在第5d從組織塊中爬出，大多呈梭形，胞漿豐滿(mǎn)，核仁清晰。一般13～20d長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底，可進(jìn)行傳代。生長(zhǎng)曲線(xiàn)符合HGFs生長(zhǎng)特點(diǎn)。制備的AGE-HSA樣本為棕褐色，熒光值為110U/mg蛋白，而HSA對(duì)照樣本為2.21U/mg蛋白。以上所有樣本經(jīng)內(nèi)毒索含量測(cè)定，均＜

6、10pg/ml。蛋白分析儀測(cè)得AGE-HSA濃度是2.5mg/ml；②MTT結(jié)果為：AGE-HSA與HGFs復(fù)合培養(yǎng)時(shí)，AGE-HSA各濃度組OD值均低于對(duì)照組，并且同一時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組OD值隨著濃度增加逐漸降低。孵育初期200μg/ml首先表現(xiàn)出與對(duì)照組的顯著差異；而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度組均顯示出與對(duì)照組的顯著差異(p＜0.05)，且高濃度200μg/ml組與低濃度0.5μg/ml組均表現(xiàn)出與其它各濃度組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05

7、)，表明AGE-HSA對(duì)HGFs抑制作用隨其濃度升高和時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)；③ELISA數(shù)據(jù)顯示：各濃度組MMP-1合成量隨時(shí)間變化逐漸增高。100μg/mlAGE-HSA組HGFs中MMP-1的合成量在培養(yǎng)初期(24小時(shí))即明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)。至72小時(shí)，100μg/ml濃度組不僅與對(duì)照組顯示出差異，而且與最低濃度0.5μg/ml組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p＜0.05)；不同濃度組在不同時(shí)間誘導(dǎo)HGFs表達(dá)MMP-8水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；④R