沙利度胺對(duì)正常及組胺刺激后人真皮成纖維細(xì)胞分泌的TGF-β1、MMP-1、TIMP-1基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景：成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層最重要的細(xì)胞之一，附著在膠原纖維上，可以合成和分泌大量的膠原蛋白，這對(duì)于維持皮膚的彈性和韌性有著重要作用。許多疾病的發(fā)生與膠原蛋白的代謝異常有明顯相關(guān)性。有研究表明系統(tǒng)性硬皮病和病理性瘢痕是由于成纖維細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)和以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積造成的。細(xì)胞因子中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，刺激膠原蛋白合成，同時(shí)可以刺激膠原酶的產(chǎn)生。TGF-β1被認(rèn)為在瘢痕形成中最重要的

2、細(xì)胞因子,可以強(qiáng)烈促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。在正常情況細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解保持著動(dòng)態(tài)平衡，以維持組織的正常結(jié)構(gòu)與功能。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)與其抑制因子基質(zhì)金屬抑制蛋白酶(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMPs)在這種平衡中起著重要作用。MMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要一員，在創(chuàng)傷修復(fù)中對(duì)啟動(dòng)膠原的降解起著關(guān)鍵作用，是膠

3、原降解的關(guān)鍵酶。TIMP-1是MMP-1最重要的抑制因子，可以與MMP-1按比例1:1形成復(fù)合體抑制該酶的活性。隨著沙利度胺(THD)在麻風(fēng)、結(jié)節(jié)性紅斑等疾病治療上取得良好效果，研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。目前有實(shí)驗(yàn)證明沙利度胺可以通過抑制TGF-β、TNF-α因子對(duì)抗肺纖維化的進(jìn)程。大量實(shí)驗(yàn)均已證明肥大細(xì)胞分泌的組胺可以刺激成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成增多，故本實(shí)驗(yàn)用組胺作為成纖維細(xì)胞的刺激因子誘導(dǎo)纖維化病理細(xì)胞模

4、型。本課題通過體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，研究沙利度胺對(duì)組胺刺激后人成纖維細(xì)胞分泌的TGF-β1、MMP-1及TIMP-1的影響。
　　目的：探討沙利度胺對(duì)正常及組胺刺激后人真皮成纖維細(xì)胞分泌的TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的mRNA的影響。
　　方法：
　　1.使用體積分?jǐn)?shù)為20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，通過消化-組織塊混合法對(duì)人正常真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。
　　2.通過波形蛋白免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定

5、。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（正常成纖維細(xì)胞）、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組。
　　4.經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)測(cè)定，沙利度胺的濃度在10-5mol/L時(shí)對(duì)正常成纖維細(xì)胞的增殖活性無影響，經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所用的組胺濃度為100UM。
　　5.采用SYBR Green I染料法熒光定量PCR測(cè)定TGF-β1的mRNA的表達(dá)情況及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　按上述分組的要求處理細(xì)胞，每組均設(shè)三個(gè)樣本，

6、接種在25mL培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后提取各組的總RNA。應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)TGF-β1 mRNA基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，并用以上測(cè)得數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　6.采用SYBR Green I染料法熒光定量PCR測(cè)定MMP-1及TIMP-1的mRNA的表達(dá)情況及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　按方法5得到MMP-1及TIMP-1 mRNA基因表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.沙利度胺對(duì)組胺誘導(dǎo)后人成纖維細(xì)胞

7、TGF-β1 mRNA的影響。
　　空白組、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組的 TGF-β1 mRNA的RQ值分別為0.9837±0.0125、0.849±0.0276、2.5653±0.0935、0.648±0.0321。各組RQ值不全相等(P＜0.05)，組內(nèi)兩兩比較時(shí)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示：經(jīng)組胺誘導(dǎo)后TGF-β1 mRNA表達(dá)量增加。沙利度胺可抑制正常的人真皮成纖維細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)，

8、且經(jīng)過組胺誘導(dǎo)后其抑制作用更顯著。
　　2.沙利度胺對(duì)組胺誘導(dǎo)后人成纖維細(xì)胞MMP-1mRNA的影響。
　　空白組、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組的MMP-1mRNA的 RQ值分別為0.9973±0.0074、1.2773±0.0351、1.071±0.0137、1.7523±0.0334。各組RQ值不全相等(P＜0.05)，且組內(nèi)兩兩比較時(shí)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示：組胺和沙利度胺可以促進(jìn)正常人真皮成

9、纖維細(xì)胞MMP-1mRNA的表達(dá)，經(jīng)過組胺誘導(dǎo)后沙利度胺對(duì)其促進(jìn)作用更明顯。
　　3.沙利度胺對(duì)組胺誘導(dǎo)后人成纖維細(xì)胞TIMP-1mRNA的影響。
　　空白組、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組的TIMP-1mRNA的RQ值分別為0.997±0.007、0.1687±0.0015、0.9563±0.0312、0.1173±0.005。對(duì)各組的RQ值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，四組數(shù)據(jù)方差不齊?？瞻捉M與組胺組相比較沒有顯著性差異；沙利度

10、胺組較空白組TIMP-1mRNARQ值降低，兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；組胺+沙利度胺組與組胺組相比較RQ降低，兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；組胺+沙利度胺組與沙利度胺組相比較RQ降低，兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示：沙利度胺可以抑制正常成纖維細(xì)胞TIMP-1mRNA表達(dá)，在組胺誘導(dǎo)后對(duì)其抑制作用更明顯。
　　結(jié)論
　　1.經(jīng)100UM組胺誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)量明顯增加。