沙利度胺對正常人真皮成纖維細胞增殖活性及膠原代謝的影響.pdf

1、背景:病理性瘢痕和局限性硬皮病是一類以真皮細胞因子活性異常及連續(xù)產(chǎn)生大量的細胞外基質蛋白為特征的纖維化性疾病。主要是由于成纖維細胞的過度生長和膠原蛋白合成、分泌紊亂以及過度沉積所造成。目前對這類疾病的治療和預防局限，效果較差。沙利度胺，被廣泛用于鎮(zhèn)靜催眠、睡眠誘導及妊娠止吐后因其明顯的致畸作用被停用。隨著沙利度胺能有效治療麻風結節(jié)性紅斑的發(fā)現(xiàn)，國內外已有研究證實沙利度胺具有抗血管生成、抗炎，免疫調節(jié)等多種生物學作用，主要通過抑制VEGF

2、、TNF-a因子影響細胞遷移、粘附凋亡，抑制腫瘤血管生成，在關節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤及一些難治性皮膚病中廣泛應用。它能抑制滑膜成纖維細胞及膠原蛋白合成，并可通過抑制細胞增值、TGF-β1、TNF-α、VEGF及膠原的表達而具有抑制肝纖維化、肺纖維化的作用[1]。它能通過干擾p38/Smad3作用通路抑制TGF-β1處理的正常及瘢痕疙瘩成纖維細胞纖連蛋白產(chǎn)生，可以證實沙利度胺具有抗瘢痕形成的潛在作用[2]。這些研究大多是從抑制炎癥因子活性，干

3、擾通路等方面進行闡述，但對其作用于真皮成纖維細胞，對細胞增殖及細胞外基質直接影響的研究甚少，本課題通過研究沙利度胺對正常真皮成纖維細胞增殖及主要細胞外基質蛋白的直接影響，為今后其對活化后成纖維細胞影響的研究奠定理論基礎，初步探討沙利度胺的抗真皮纖維化的潛在作用，為防止術后瘢痕形成及硬皮病的臨床治療提供新的指導思路。
　　目的:探索沙利度胺對正常人真皮成纖維細胞的增殖活性及膠原表達的影響，及膠原代謝的調節(jié)機制。
　　方法:

4、r>　　1、使用含體積分數(shù)20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，通過消化-組織塊混合法進行人正常真皮成纖維細胞原代培養(yǎng)，并通過對波形蛋白免疫組化染色，進行細胞鑒定。
　　2、CCK-8法檢測成纖維細胞增殖
　　實驗用第4代成纖維細胞。細胞消化后按相同密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組均設置6個重復孔。分別在每組中加入含有濃度分別為0（空白對照組）、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L含沙利度胺

5、的DMEM培養(yǎng)基(標為A0、A-4、A-5、A-6、A-7)。同時設立調零孔，調零組只加空白培養(yǎng)基，用CCK-8法檢測沙利度胺作用24h后細胞在560nm處的光密度值（OD值），判斷在不同的濃度下，沙利度胺對正常人真皮成纖維細胞增殖的影響，并對結果進行統(tǒng)計學分析。
　　3、westernblot及熒光定量PCR法測定Col1-a1蛋白及其mRNA表達水平，以及膠原蛋白合成相關調節(jié)因子(TGF-β1、MMP-1、TIMP-1)mRN

6、A的表達情況。
　　成纖維細胞經(jīng)傳代后隨機分為5組，分別加入含沙利度胺濃度為0、10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L，10-7mol/L的培養(yǎng)基，每組設三個樣本。均接種在25mL培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后提取各組總RNA。應用熒光定量PCR對Col1-a1、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1基因的表達量進行測定。同樣分組，接種于75ml培養(yǎng)瓶，24h提取各組總蛋白，蛋白定量、電泳、轉膜、加抗體并進行化學發(fā)

7、光和圖像相對定量分析，應用westernblot法對Col1-a1進行蛋白水平測定。
　　4、ELISA法檢測TGF-β1分泌量并做統(tǒng)計學分析。
　　離心收集以上PCR各組細胞上清，通過ELISA法檢測成纖維細胞外TGF-β1分泌情況。所得數(shù)據(jù)結果進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1、CCK-8的結果顯示:5個處理組的細胞活性不全相等，即不同濃度沙利度胺對正常人真皮成纖維細胞的增殖有抑制作用，（組間比較F=18.

8、023，P＜0.05），組內比較時，A組中，A-4A-5A-6能抑制細胞增殖，且兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，A-7與對照組A0之間無顯著性差異(P＞0.05)。沙利度胺10-4、10-5、10-6藥物濃度與細胞活性符合直線負相關，相關系數(shù)R=-0.972,P=0.028＜0.05。
　　2、Col1-a1蛋白及其mRNA表達水平，以及TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的mRNA數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析如下:沙利度胺不同濃度組處理正常成纖維細

9、胞24h后，COL1-A1mRNA及其蛋白表達均低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。組內兩兩比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。相關分析表明:藥物濃度與Col1-a1表達符合直線負相關，PCR檢測中相關系數(shù)R=-0.972，western中相關系數(shù)R=-0.984，P＜0.05。
　　不同濃度組沙利度作用于正常成纖維細胞后，TGF-β1mRNA的表達較正常對照組均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。組內比較時

10、，除A-6和A-7外的任兩組間比較均具有統(tǒng)計學意義，A-5時抑制作用最明顯。MMP-1mRNA表達均有不同程度的升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且兩兩比較各濃度組之間具有顯著性差異(P＜0.05)。TIMP-1mRNA表達較空白對照組降低，且差異顯著(P＜0.05)，組內多重比較時除A-4和A-5之間無顯著性差異外，其余任處理組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　4、ELISA法測定TGF-β1實驗結果統(tǒng)計分析如下:A-

11、4、A-5較空白對照組分泌量減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但A-4、A-5組內比較兩者并無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結論:
　　1、正常人真皮成纖維細胞原代培養(yǎng)成功，細胞呈長梭形，且波形蛋白表達陽性
　　2、CCK-8實驗顯示THD作用于人正常真皮成纖維細胞時，10-4、10-5、10-6能抑制細胞增殖，其藥物濃度與細胞活性符合直線負相關。但10-7濃度時對正常成纖維細胞增殖無影響。
　　3、