光老化人真皮成纖維細(xì)胞通過“旁觀者效應(yīng)”對正常人真皮成纖維細(xì)胞氧化損害、增殖、老化及自噬活性的影響.pdf

1、研究背景:
　　皮膚的老化是由內(nèi)源性和外源性因素決定的，外源性因素如太陽輻射、吸煙或污染，其中太陽輻射占主要作用，故常將外源性因素引起的老化稱為光老化。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過紫外線照射等應(yīng)激刺激可出現(xiàn)提早衰老稱為應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老(Stress-induced premature senescence，SIPS)。我們及國內(nèi)外等多個研究小組均通過連續(xù)多次中波紫外線(Ultraviolet B，UVB)照射HDFs成功構(gòu)建了UVB誘

2、導(dǎo)的提前衰老細(xì)胞模型(UVB-SIPS)。放射學(xué)家將直接受損傷細(xì)胞將所受損害傳播至其他沒有直接受損細(xì)胞的現(xiàn)象稱為旁觀者效應(yīng)。近些年來，已有多名學(xué)者證明，經(jīng)紫外線單次照射的人真皮成纖維細(xì)胞(Humandermal fibroblasts，HDFs)通過旁觀者效應(yīng)使周圍成纖維細(xì)胞發(fā)生諸如增殖活性降低、DNA損傷、周期阻滯等各種生物學(xué)表現(xiàn)。然而，對于光老化人真皮成纖維細(xì)胞能否通過旁觀者效應(yīng)影響其周圍正常人真皮成纖維細(xì)胞尚未見報道。
　　

3、目的:
　　研究光老化人真皮成纖維細(xì)胞能否通過“旁觀者效應(yīng)”對正常人真皮成纖維細(xì)胞的增殖、老化及自噬等產(chǎn)生影響及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.HDFs的分離與培養(yǎng)從本院泌尿外科手術(shù)室獲取健康青壯年男性包皮環(huán)切術(shù)后的組織后分離表真皮，對獲得的HDFs正常培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的4～10代細(xì)胞進(jìn)行實驗。
　　2.UVB-SIPS造模將處于對數(shù)生長期的4～10代HDFs進(jìn)行每天1次10mJ/cm2UVB照射，連續(xù)照射5

4、天后，靜置3天。
　　3.細(xì)胞培養(yǎng)上清液的收集正常培養(yǎng)2-3天未經(jīng)處理的HDFs及光老化HDFs后，分別收集各組培養(yǎng)上清液，即正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液(Conditioned mediumof normal fibroblasts，F(xiàn)B-CM)及UVB誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液(Conditoned medium of photoaging fibroblasts，PH-CM)，收集后放入-80℃冰箱中備用。
　　

5、4.PH-CM對HDFs的氧化損害將PH-CM孵育正常HDFs4天后，使用細(xì)胞熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中活性氧及線粒體膜電位的水平。
　　5.PH-CM對HDFs增殖的影響將PH-CM孵育正常HDFs20天后，使用CCK-8法及EDU染色法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。
　　6.PH-CM對HDFs提前衰老的影響將PH-CM孵育正常HDFs20天后，使用衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（Senescene asso

6、ciated-β-galactosidase，SA-β-Gal）化學(xué)染色法檢測細(xì)胞衰老。
　　7.PH-CM對HDFs自噬活性的影響將PH-CM孵育正常HDFs20天后，使用吖啶橙染色法檢測細(xì)胞自噬水平、細(xì)胞免疫熒光染色法及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-B的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.PH-CM可加劇HDFs的氧化損害細(xì)胞熒光染色法及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示:PH-CM孵育組培養(yǎng)體系

7、中的HDFs的活性氧水平及線粒體膜電位去極化水平均高于FB-CM孵育組，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。培養(yǎng)基中加入抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N acetyl L cysteine，NAC)可減輕PH-CM對HDFs的氧化損害。
　　2.PH-CM可抑制HDFs增殖 CCK-8結(jié)果顯示PH-CM孵育組細(xì)胞增殖活性較FB-CM孵育組明顯下降，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);細(xì)胞周期結(jié)果顯示PH-CM組G1期

8、細(xì)胞百分比明顯低于對照組，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);EDU染色結(jié)果提示PH-CM組S期細(xì)胞百分比明顯高于對照組，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.PH-CM可加速HDFs衰老表型 PH-CM孵育組中HDFs的SA-β-Gal染色陽性率明顯高于FB-CM孵育組，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.PH-CM可抑制HDFs自噬吖啶橙染色結(jié)果顯示PH-CM孵育組HDFs自噬小泡熒光