應用犬真皮成纖維細胞構建半月板的實驗研究.pdf

1、種子細胞是纖維軟骨組織工程研究的重要內容。真皮成纖維細胞(DFs)是真皮組織中合成細胞外基質的主要細胞，也是人體中分布最為廣泛，數(shù)量最多，最易于獲取和體外培養(yǎng)的細胞。我實驗室早期的研究發(fā)現(xiàn)軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(CDMP1)可以誘導人DFs向軟骨細胞表型分化。本課題將深入探索DFs作為纖維軟骨種子細胞的可能性和可行方案。 第一部分應用含有100ng/ml CDMP1軟骨誘導液培養(yǎng)成年Beagle犬腹部皮膚分離培養(yǎng)的第4代DFs。6天

2、后，部分DFs呈星形或多角形，免疫組化染色顯示有軟骨特異的II型膠原分泌，RT-PCR檢測也表明有II型膠原，aggrecan和Sox9表達，但是誘導10天時，這些表達均轉為陰性。表明CDMP1可以誘導DFs向軟骨細胞表型分化，但不能長期維持。 第二部分我們以聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)作為支架材料，為DFs提供一個三維的生長環(huán)境，以含有CDMP1的軟骨誘導液培養(yǎng)細胞材料復合物。對體外培養(yǎng)4周和6周的復合物進行組織學和免

3、疫組織化學的染色，觀察纖維軟骨的形成。定量PCR測定纖維軟骨特異性基因的表達。結果：CDMP1誘導組中細胞增殖和細胞合成GAG量明顯較對照組高，體外培養(yǎng)4周后，誘導組復合物中形成纖維軟骨樣組織，6周后，形成的組織更加成熟，而且，I型、II型膠原、GAG和aggrecan都有較高的表達。而對照組中只有I型膠原和微量aggrecan表達，因而可以確定CDMP1具有誘導DFs構建組織工程纖維軟骨的作用。 第三部分將體外誘導培養(yǎng)2周的半

4、月板形細胞材料復合物回植入體內，修復犬自體半月板的全缺損模型，回植3個月和6個月后取材，對新生的半月板組織進行組織學和免設組織化學染色。結果：誘導組在術后3個月時，新生的半月板組織中細胞呈典型的軟骨細胞形態(tài)特征；6個月時，形成的組織與正常半月板組織非常相似，不僅細胞呈軟骨細胞特征，而且細胞外基質中有大量平行排列的膠原纖維。而在對照組中未見有典型的纖維軟骨樣組織形成。 總之，本課題研究證明，DFs在CDMP1的作用下可以向纖維軟骨