以人毛囊外根鞘細胞和成纖維細胞構建皮膚替代物的實驗研究.pdf

1、目的：作為毛囊外根鞘一部分的bulge 區(qū)是近來公認的表皮干細胞池。
　　 通過分離人毛囊外根鞘細胞，聯合人成纖維細胞在Integra 膠原基質支架上構建皮膚替代物進行體內體外研究，探索一種快速,簡單而有效的皮膚組織構建方法。
　　 方法：利用除皺術獲得的頭皮，以0.5％Dispase液從中分離出帶外根鞘的毛囊并解剖分離出其中下段，然后以0.05[％]胰酶-0.53Mm EDTA混合液消化分離出毛囊外根鞘細胞，用含限定性

2、表皮細胞無血清培養(yǎng)基添加物的無血清培養(yǎng)基進行細胞的原代和傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞用作細胞學研究及構建皮膚替代物的種子細胞。人表皮細胞與成纖維細胞從切除的新生兒包皮分離培養(yǎng)獲得。分別用表皮干細胞抗體角蛋白15，角蛋白19和整合素?1對各代毛囊外根鞘細胞,表皮細胞和成纖維細胞進行熒光染色作細胞學鑒定。以Ki-67 免疫熒光染色鑒定分離的毛囊外根鞘細胞的增殖活性。以細胞計數法繪制毛囊外根鞘細胞的生長曲線。種植人成纖維細胞入膠原基質構建了真皮支架后2

3、4小時，隨后接種毛囊外根鞘細胞，先進行4天的三維立體液態(tài)培養(yǎng)，后改為氣液交界面培養(yǎng)7天以供移植。分別以MTT和DAPI染色監(jiān)測細胞在支架基質上的增殖活性。移植體外構建的皮膚替代物于裸鼠的全層皮膚缺損創(chuàng)面以進行體外研究，分別在2周，4周兩個時相點采集創(chuàng)面組織標本行組織學結構分析，然后分別以HLA-A，人角蛋白MNF-116和人波形蛋白V9行免疫組化染色鑒定移植物的細胞來源。
　　 結果：采用我們的方法分離的毛囊外根鞘細胞具有較高的

4、增殖活性，Ki-67 染色陽性。角蛋白15，角蛋白19和整合素?1的陽性染色均可見于原代毛囊外根鞘細胞和毛囊bulge 區(qū)。在第二代毛囊外根鞘細胞中，角蛋白15和整合素?1的表達消失，但仍然可見角蛋白19的陽性表達。與毛囊外根鞘細胞,成纖維細胞單獨接種在膠原基質支架上相比，兩種細胞聯合培養(yǎng)在膠原基質支架上顯示出更高的增殖活性。該方法構建的皮膚替代物移植于裸鼠創(chuàng)面2周后，HE染色可見到復層的角化表皮層。HLA-A 陽性表達可見于移植物皮膚

5、全層，表皮層可見人角蛋白MNF-116 陽性表達，真皮層可見人Vimentin 陽性表達。4周時表皮層結構分化更完全，可見到類似于人角質層，顆粒層，棘層和基底層等樣的結構。
　　 結論：該研究顯示，我們的細胞分離技術能快速分離培養(yǎng)出毛囊外根鞘細胞，并且這些細胞含有bulge 干細胞。以含bulge 干細胞的人毛囊外根鞘細胞，聯合成纖維細胞在膠原基質支架上構建的皮膚替代物，移植到裸鼠創(chuàng)面模型后在2周內即可形成類似于人表皮和真皮的組