以人毛囊外根鞘細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)建皮膚替代物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：作為毛囊外根鞘一部分的bulge 區(qū)是近來(lái)公認(rèn)的表皮干細(xì)胞池。
　　 通過(guò)分離人毛囊外根鞘細(xì)胞，聯(lián)合人成纖維細(xì)胞在Integra 膠原基質(zhì)支架上構(gòu)建皮膚替代物進(jìn)行體內(nèi)體外研究，探索一種快速,簡(jiǎn)單而有效的皮膚組織構(gòu)建方法。
　　 方法：利用除皺術(shù)獲得的頭皮，以0.5％Dispase液從中分離出帶外根鞘的毛囊并解剖分離出其中下段，然后以0.05[％]胰酶-0.53Mm EDTA混合液消化分離出毛囊外根鞘細(xì)胞，用含限定性

2、表皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基添加物的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞用作細(xì)胞學(xué)研究及構(gòu)建皮膚替代物的種子細(xì)胞。人表皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞從切除的新生兒包皮分離培養(yǎng)獲得。分別用表皮干細(xì)胞抗體角蛋白15，角蛋白19和整合素?1對(duì)各代毛囊外根鞘細(xì)胞,表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行熒光染色作細(xì)胞學(xué)鑒定。以Ki-67 免疫熒光染色鑒定分離的毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖活性。以細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制毛囊外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。種植人成纖維細(xì)胞入膠原基質(zhì)構(gòu)建了真皮支架后2

3、4小時(shí)，隨后接種毛囊外根鞘細(xì)胞，先進(jìn)行4天的三維立體液態(tài)培養(yǎng)，后改為氣液交界面培養(yǎng)7天以供移植。分別以MTT和DAPI染色監(jiān)測(cè)細(xì)胞在支架基質(zhì)上的增殖活性。移植體外構(gòu)建的皮膚替代物于裸鼠的全層皮膚缺損創(chuàng)面以進(jìn)行體外研究，分別在2周，4周兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)采集創(chuàng)面組織標(biāo)本行組織學(xué)結(jié)構(gòu)分析，然后分別以HLA-A，人角蛋白MNF-116和人波形蛋白V9行免疫組化染色鑒定移植物的細(xì)胞來(lái)源。
　　 結(jié)果：采用我們的方法分離的毛囊外根鞘細(xì)胞具有較高的

4、增殖活性，Ki-67 染色陽(yáng)性。角蛋白15，角蛋白19和整合素?1的陽(yáng)性染色均可見(jiàn)于原代毛囊外根鞘細(xì)胞和毛囊bulge 區(qū)。在第二代毛囊外根鞘細(xì)胞中，角蛋白15和整合素?1的表達(dá)消失，但仍然可見(jiàn)角蛋白19的陽(yáng)性表達(dá)。與毛囊外根鞘細(xì)胞,成纖維細(xì)胞單獨(dú)接種在膠原基質(zhì)支架上相比，兩種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)在膠原基質(zhì)支架上顯示出更高的增殖活性。該方法構(gòu)建的皮膚替代物移植于裸鼠創(chuàng)面2周后，HE染色可見(jiàn)到復(fù)層的角化表皮層。HLA-A 陽(yáng)性表達(dá)可見(jiàn)于移植物皮膚

5、全層，表皮層可見(jiàn)人角蛋白MNF-116 陽(yáng)性表達(dá)，真皮層可見(jiàn)人Vimentin 陽(yáng)性表達(dá)。4周時(shí)表皮層結(jié)構(gòu)分化更完全，可見(jiàn)到類似于人角質(zhì)層，顆粒層，棘層和基底層等樣的結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：該研究顯示，我們的細(xì)胞分離技術(shù)能快速分離培養(yǎng)出毛囊外根鞘細(xì)胞，并且這些細(xì)胞含有bulge 干細(xì)胞。以含bulge 干細(xì)胞的人毛囊外根鞘細(xì)胞，聯(lián)合成纖維細(xì)胞在膠原基質(zhì)支架上構(gòu)建的皮膚替代物，移植到裸鼠創(chuàng)面模型后在2周內(nèi)即可形成類似于人表皮和真皮的組