毛囊真皮細胞在真皮替代物中誘導外根鞘細胞形成毛囊樣結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、成熟毛囊由屬于上皮部分的外根鞘與內(nèi)根鞘和屬于真皮部分的毛乳頭與真皮鞘組成。毛囊是角質(zhì)形成細胞、黑素細胞和間質(zhì)真皮細胞的干細胞庫，已成為研究成體干細胞增生、遷移和分化、真表皮細胞間相互作用以及組織器官發(fā)育與再生過程的重要對象和工具。其中毛囊重建的研究對美容、藥學、創(chuàng)傷愈合都有著重要影響。 缺乏皮膚附屬器和疤痕形成是目前組織工程皮膚替代物的共同缺陷。毛囊可能在提高皮膚創(chuàng)傷愈合速度、減少皮膚瘢痕形成、提高傷口愈合質(zhì)量上起著重要作用。毛

2、囊真皮細胞在誘導表皮生長和真皮最后結(jié)構(gòu)中有著重要的發(fā)育功能。毛囊隆突上皮細胞和毛囊真皮細胞的干細胞特性使毛囊來源的組織工程皮膚替代物有可能產(chǎn)生皮膚附屬器。因此，用毛囊細胞來構(gòu)建皮膚替代物以產(chǎn)生皮膚附屬器的研究成為熱點。 學者們構(gòu)建了細胞移植、細胞注射、條件器官型移植等多種毛囊重建模型，并成功地在特定部位(如腎包膜下)誘導產(chǎn)生了毛囊、毛發(fā)等皮膚附屬器。但這些研究模型缺乏支架，誘導環(huán)境不是正常毛囊的生長環(huán)境，并不實用。隨著組織工程技

3、術(shù)的發(fā)展，以膠原凝膠為支架，更接近正常毛囊生長環(huán)境的皮膚替代物毛囊誘導模型應運而生。但單純以各種毛囊來源細胞構(gòu)建的雙層皮膚替代物體外均未能誘導出毛囊樣結(jié)構(gòu)。移植后僅Gharzi的大鼠研究取得突破，成功誘導出毛囊和毛發(fā)。Limat和Havlickova以I型膠原成纖維細胞和/或毛乳頭細胞凝膠為基礎(chǔ)，在富含基底膜成分的細胞外基質(zhì)Matrigel中，用毛乳頭細胞和外根鞘細胞在體外誘導出囊腫樣或梭形細胞團毛囊樣結(jié)構(gòu)，并對誘導產(chǎn)物進行了細胞增生、

4、分化及培養(yǎng)基影響因素的研究。 毛囊形態(tài)發(fā)生的基本過程是：來源于真皮的起始信號啟動局部表皮形成基板，基板發(fā)出的表皮信號反過來作用于間質(zhì)，形成真皮細胞凝集團，在真皮細胞凝集團的信號作用下基板細胞增生形成毛囊胚芽，并繼續(xù)向真皮中生長，包繞真皮細胞凝集團，使之發(fā)育成毛乳頭，而上皮細胞發(fā)育成同心圓排列的各上皮細胞系，形成毛囊。這些信號中，β-catenin起著非常關(guān)鍵的毛囊發(fā)育起始誘導作用，而位于其下游的分泌型蛋白Sonic hedgeh

5、og(Shh)在表皮一問質(zhì)信號中起主要作用，調(diào)節(jié)毛囊表皮增生和進一步向間質(zhì)生長及毛乳頭形成。研究誘導產(chǎn)物的β-catenin和Shh表達，可以初步把握wnt信號表達與誘導結(jié)構(gòu)形成的關(guān)系。 本實驗對文獻報道的繁瑣毛囊真皮成分細胞分離方法進行了改進；對用毛乳頭細胞、真皮鞘細胞和外根鞘細胞構(gòu)建的雙層皮膚替代物產(chǎn)生毛囊的可能性進行了探討；并對毛乳頭細胞、真皮鞘細胞復方殼多糖真皮基質(zhì)凝膠基礎(chǔ)上，真皮鞘細胞與外根鞘細胞的混合Matrigel

6、凝膠(雙層真皮替代物)誘導毛囊形成情況及裸鼠移植后的情況進行了組織學、免疫組化研究，并以包皮細胞來源的雙層皮肽替代物、正常人毛囊、裸鼠皮膚(毛囊)為對照，進行了β-catenin、Shh免疫印跡蛋白表達分析。本實驗的主要研究結(jié)果如下：(1)真表皮交界處橫斷頭皮標本，拔出完整下段毛囊，解剖顯微鏡下用兩支帶針頭的1mL塑料注射器游離毛乳頭，移液槍捕捉，膠原酶消化的方法可快速獲得純化毛乳頭細胞。(2)堿性磷酸酶染色可鑒定低代毛乳頭細胞和真皮鞘

7、細胞。(3)毛囊來源細胞所構(gòu)建的皮膚角化突出，表皮細胞排列緊密，但體外及常規(guī)、皮下移植后均無明確毛囊樣結(jié)構(gòu)形成，與已報道的大多數(shù)研究結(jié)果一致。(4)體外，真皮鞘細胞與外根鞘細胞的混合Matrigel凝膠在毛乳頭細胞、真皮鞘細胞復方殼多糖真皮替代物上分別誘導出平均直徑47±5μm和38±2μm細胞團或囊腫樣器官型毛囊樣結(jié)構(gòu)。裸鼠皮下埋植后，中心完全角化的囊腫樣結(jié)構(gòu)突出，平均直徑分別為133±12μm和131±9μm，可見典型毛球樣結(jié)構(gòu)，并

8、見誘導的器官型毛囊樣結(jié)構(gòu)向真皮替代物內(nèi)生長的現(xiàn)象。PAS染色，移植后的結(jié)構(gòu)有基底膜樣物質(zhì)包繞，結(jié)構(gòu)周邊有PAS染色陽性細胞。AS染色，誘導結(jié)構(gòu)周圍有藍色結(jié)締組織鞘樣結(jié)構(gòu)形成。體外和移植標本均表達CK6、CK14、AE1、AE3，角蛋白表型與正常毛囊一致。(5)體外及移植后標本均表達β-catenin。免疫印跡實驗，DPC及DSC雙層真皮替代物誘導系統(tǒng)移植前后β-catenin和Shh均有較強表達，移植后標本比移植前強，但弱于頭皮標本。

9、 本研究建立了毛囊真皮成分細胞的快速高效純化培養(yǎng)方法；構(gòu)建了完全由人毛囊細胞來源的雙層皮膚替代物，對帶皮膚附屬器的雙層人工皮膚的研究進行了初步的探索，提出有多向分化潛能的上皮干細胞與有誘導能力的毛囊真皮細胞結(jié)合是組織工程皮膚能產(chǎn)生皮膚附屬器的方案；在真皮替代物中首次成功構(gòu)建了DSC與ORSC的體外器官型毛囊誘導模型。裸鼠移植后，誘導形成了毛球、基底膜和結(jié)締組織鞘樣結(jié)構(gòu)。免疫組化研究證實誘導結(jié)構(gòu)向毛囊分化。免疫印跡和免疫組化研究初步