毛乳頭細胞凝膠球的構(gòu)建及其毛囊誘導的初步研究.pdf

1、組織工程皮膚在頑固性潰瘍及小面積創(chuàng)面方面部取得了較好的療效，但遺憾的是由于缺乏皮膚附屬器，使得組織工程皮膚同正常皮膚在形態(tài)、功能、質(zhì)地等方面仍然有一定差距。毛囊是皮膚重要的附屬器，不僅具有美容作用，還參與皮膚的生理代謝、防御、自我更新等。毛乳頭位于毛囊底部，對毛囊的形成、發(fā)生發(fā)育、生長周期調(diào)控等方面均有至關(guān)重要的作用，并且研究表明毛乳頭細胞的毛囊誘導能力與其凝集性生長特性密切相關(guān)。
　　毛囊的體內(nèi)誘導試驗較易成功，但其體外誘導卻未

2、取得突破，其中最重要的原因是毛囊形成不僅需要上皮和間質(zhì)細胞的相互作用，同時還需要一個適宜的微環(huán)境。在體內(nèi)，血液的流動為毛囊的發(fā)育提供了一個由信號分子、激素和細胞外基質(zhì)等組成并相互作用的微環(huán)境，這種復雜的微環(huán)境很難在體外模擬。隨著灌注培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的營養(yǎng)供應(yīng)、機械力作用、分子滲透等可以在一定程度上被模擬。
　　本研究中，擬分離培養(yǎng)大鼠觸須部毛乳頭，建立了毛乳頭細胞凝膠球的三維培養(yǎng)方，并利用灌注培養(yǎng)裝置進行含毛乳頭細胞凝

3、膠球的組織工程皮膚的灌注培養(yǎng)，對毛囊的體外誘導進行初步探索。
　　目的:
　　1.分析對比顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法與兩步酶消化法分離培養(yǎng)大鼠觸須部毛乳頭的效果，從而建立高效、快捷、簡便分離大鼠觸須部毛乳頭的方法。
　　2.創(chuàng)建膠原凝膠法以構(gòu)建富含細胞外基質(zhì)的三維毛乳頭細胞凝膠球，探討適宜的體外毛乳頭重建方式，并恢復高代毛乳頭細胞的凝集性生長特性。
　　3.制備含有毛乳頭細胞凝膠球的雙層組織工程皮膚，在灌注式生物反

4、應(yīng)器中進行動態(tài)培養(yǎng)，觀察體外毛囊誘導情況。
　　方法:
　　1.采用顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法與兩步酶消化法，分別進行SD大鼠觸須部毛乳頭的分離及傳代培養(yǎng)，觀察比較毛乳頭收獲率、形態(tài)、類型、貼壁時間、操作效率等，并進行統(tǒng)計學分析;
　　2.選用鼠尾膠原制成的膠原凝膠為支架材料，采用不同凝膠量及不同細胞量組合構(gòu)建三維毛乳頭細胞凝膠球，探討適宜的體外重建毛乳頭的方式，觀察不同組合成球的時間、大小、形態(tài);
　　3.分別采

5、用1代及6代毛乳頭細胞構(gòu)建凝膠球，比較其活力，通過α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、多能蛋白聚糖(versican)免疫熒光染色檢測毛乳頭細胞凝膠球的凝集性及毛囊誘導力;
　　4.運用兩步酶消化法分離培養(yǎng)人的角質(zhì)形成細胞(keratinocyte，KC)、成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)b）并傳代培養(yǎng)，制備含有毛乳頭細胞凝膠球的組織工程雙層皮膚，在灌注式生物反應(yīng)器中進行動態(tài)培養(yǎng)，并與靜態(tài)對比，10天后取材進行HE染色，對比觀察組

6、織結(jié)構(gòu)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法和兩步酶消化法都能獲得完整毛乳頭，兩步酶消化法操作時間短，獲得的毛乳頭數(shù)量多，包括觸須型和觸須部被毛毛乳頭;而顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法獲得的毛乳頭數(shù)量較少，純度較高;但兩種方法獲得的毛乳頭在貼壁時間、細胞遷出時間上無顯著性差異;
　　2.創(chuàng)建的膠原凝膠法能成功構(gòu)建三維毛乳頭細胞凝膠球;
　　3.獲得的凝膠球形態(tài)均為圓形或橢圓形，直徑在200-1250μ

7、m大小不等;細胞數(shù)與凝膠量的多少，均能對成球直徑產(chǎn)生影響，且有交互作用;在探索的實驗條件中，100μl凝膠+105個細胞情況下得到的成球直徑預(yù)測值最小，為352μm;隨著細胞量的減少、凝膠量的增多，凝膠球直徑有逐漸增大的趨勢。
　　4.將1代及6代毛乳頭細胞構(gòu)成的凝膠球移出到新的培養(yǎng)板后可觀察到1代毛乳頭細胞凝膠球周邊可見完整毛乳頭細胞凝集性生長的細胞團，而6代DPCs凝膠球可見單個毛乳頭細胞呈放射狀遷出;
　　5.1代和6

8、代毛乳頭細胞凝膠球α-SMA、versican免疫熒光檢測均為陽性;而二維培養(yǎng)的6代毛乳頭細胞α-SMA、versican免疫熒光檢測為陰性;
　　6.灌注式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的組織工程皮膚，10天后取材行HE染色顯示，表皮真皮結(jié)構(gòu)較靜態(tài)培養(yǎng)的層次更為清晰，表皮層未見角化過度或脫落;
　　7.相比于靜態(tài)培養(yǎng)，在灌注培養(yǎng)中，毛乳頭細胞凝膠球與人Fb、KC構(gòu)建的組織工程皮膚契合更佳;并且在凝膠球上方可見表皮下陷，形成類似“毛芽”樣