順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生Ferroptosis及其機制的初步研究.pdf

1、本文分兩個部分進行探討：
　　第一部分:順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生ferroptosis及其機制的初步探討
　　目的:觀察順鉑誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生ferroptosis的現(xiàn)象，初步探討其作用機制。
　　方法:1.人非小細胞肺癌細胞株A549、H460、H358、Calu-1，人結(jié)腸癌細胞株HCT116和人纖維肉瘤細胞株HT1080，分別與化療藥物順鉑、多柔比星、5-氟尿嘧啶、紫杉醇和柳氮磺胺嘧啶治療及ferroptosis特異性

2、抑制劑ferrostatin-1共同培養(yǎng)。MTT法檢測細胞活力，同時觀察凋亡抑制劑z-vad-fmk、壞死抑制劑necrostatin-1、自噬抑制劑chloroquine、ferroptosis抑制劑ferrostatin-1及鐵螯合劑deferoxamine能否逆轉(zhuǎn)順鉑的細胞毒作用。2.透射電子顯微鏡觀察順鉑處理后HCT116細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。3.流式細胞術(shù)檢測順鉑處理后HCT116細胞內(nèi)ROS水平的變化。4.SiRNA沉默HCT

3、116細胞ferroptosis相關(guān)基因IREB2，MTT法檢測其經(jīng)順鉑處理后細胞活力的變化。5.生化法檢測順鉑處理后HCT116細胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidases，GPXs）活性的變化。
　　結(jié)果:1.順鉑對A549細胞和HCT116細胞的生長抑制作用可以被ferroptosis特異性抑制劑ferrostatin-1(fer-1)部分逆轉(zhuǎn)(細胞

4、活力HCT116細胞：順鉑組=34.70±2.06％，順鉑+fer-1組=46.79±2.84％；A549細胞：順鉑組=57.99±3.07％，順鉑+fer-1組=65.23±3.37％，P<0.05）；鐵螯合劑deferoxamine、ferroptosis抑制劑ferrostatin-1和凋亡抑制劑z-vad-fmk均可部分逆轉(zhuǎn)順鉑對HCT116細胞的生長抑制作用，而壞死抑制劑necrostatin-1和自噬抑制劑chloroqui

5、ne則無此作用。2.順鉑處理的HCT116細胞出現(xiàn)ferroptosis特異性超微形態(tài)改變：線粒體明顯皺縮及雙層膜密度增加。3.順鉑作用后HCT116細胞內(nèi)ROS水平增高，而ferroptosis特異性抑制劑β-ME可明顯抑制上述改變。4.SiRNA沉默IREB2基因后，順鉑對HCT116細胞的細胞毒作用明顯減弱。5.順鉑可明顯降低HCT116細胞內(nèi)GSH含量，并導(dǎo)致GPXs活性下降。
　　結(jié)論:1.順鉑對腫瘤細胞的生長抑制作用可

6、以被ferroptosis抑制劑部分逆轉(zhuǎn)，同時順鉑可以導(dǎo)致腫瘤細胞出現(xiàn)ferroptosis特異性的超微形態(tài)改變，引起ferroptosis相關(guān)的ROS水平增加，表明其可以誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生ferroptosis。2.靶向沉默ferroptosis相關(guān)基因IREB2可明顯減少順鉑誘導(dǎo)的HCT116細胞的死亡；3.順鉑通過減少細胞內(nèi)GSH含量，降低GPXs活性來誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生ferroptosis。
　　第二部分:Erastin、沉

7、默GPX4與順鉑的協(xié)同抗腫瘤作用
　　目的:Ferroptosis具有獨特的形態(tài)特征、基因表達、分子通路和嚴密的調(diào)控系統(tǒng)，可能是腫瘤治療的一個新思路。本研究擬觀察ferroptosis激活劑erastin、靶向沉默GPX4與順鉑的協(xié)同抗腫瘤作用。
　　方法:MTT法檢測ferroptosis激活劑erastin聯(lián)合順鉑對HCT116及A549細胞活性的影響，流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS的變化，生化法檢測細胞內(nèi)GSH含量的變化及

8、GPXs酶活性的變化。MTT法檢測siRNA沉默GPX4聯(lián)合順鉑對HCT116細胞活性的影響，流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS的變化，生化法檢測細胞內(nèi)GSH含量的變化及GPXs酶活性的變化。
　　結(jié)果:Erastin聯(lián)合順鉑組HCT116及A549的細胞活力顯著低于erastin組和順鉑組。相比erastin組和順鉑組，erastin聯(lián)合順鉑組可顯著增加細胞內(nèi)ROS水平，減少GSH含量及GPXs酶活性。Ferroptosis抑制劑β-M