縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間信號(hào)影響順鉑抑制腫瘤作用及其機(jī)理研究.pdf

1、本研究將為闡明腫瘤對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理提供新的依據(jù)和理論基礎(chǔ)，為癌痛患者化療時(shí)合理使用鎮(zhèn)痛藥提供理論依據(jù)。 第一章由Cx26/Cx32組成的縫隙連接對(duì)順鉑毒性的影響 目的： 本研究擬在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx26/Cx32的HeLa細(xì)胞上，用多種方法改變GJ功能，通過觀察GJ功能改變對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響，深入探討GJ與順鉑細(xì)胞毒性的關(guān)系。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx26/Cx32的HeLa細(xì)胞，用"

2、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法"和SRB法測(cè)定順鉑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。 結(jié)果： 1.不同細(xì)胞生長(zhǎng)密度對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在生長(zhǎng)融合和生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞，5μM順鉑作用1小時(shí)后，都能夠顯著地降低細(xì)胞集落形成率。在生長(zhǎng)融合細(xì)胞，順鉑對(duì)細(xì)胞集落生長(zhǎng)的抑制率明顯高于生長(zhǎng)未融合細(xì)胞。 2.改變Connexin表達(dá)對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 Western Blotting結(jié)果顯示，未加dox

3、ycycline的細(xì)胞無Cx表達(dá)。隨著doxycycline濃度的增加，Hela細(xì)胞內(nèi)Cx26/Cx32蛋白表達(dá)水平逐漸增加。細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，隨著doxycycline濃度的增加，細(xì)胞通過GJ的熒光傳遞功能逐漸增強(qiáng)。 3.抑制GJ功能對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，25μM oleamide組和10μM18-α—GA組的細(xì)胞熒光傳遞功能顯著降低。 4.增強(qiáng)GJ功能對(duì)順鉑細(xì)

4、胞毒性的影響 細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，10μM RA組的細(xì)胞熒光傳遞功能增強(qiáng)。 結(jié)論： 1.GJ形成能夠顯著增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性；而Cx在未形成GJ前并不影響順鉑的細(xì)胞毒性。 2.降低GJ功能可降低順鉑的細(xì)胞毒性。 3.增加GJ功能可增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。 第二章不同Cx組成的縫隙連接對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 目的： 本研究擬用已經(jīng)建立的，轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)單一 Cx

5、26或Cx32的Hela細(xì)胞，以及天然表達(dá)Cx43的TM4細(xì)胞，觀察由不同Cx組成的GJ對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響；并探討GJ的功能狀態(tài)與順鉑細(xì)胞毒性的關(guān)系。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)單一 Cx26，Cx32的HeLa細(xì)胞及天然表達(dá)Cx43的睪丸支持細(xì)胞，用“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”測(cè)定順鉑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。用不同密度接種細(xì)胞的方法，獲得生長(zhǎng)融合細(xì)胞與生長(zhǎng)未融合細(xì)胞。在上述不同密度接種的細(xì)胞，觀察由單一 Cx26，Cx32

6、及Cx43組成的GJ對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性影響。 結(jié)果： 1.轉(zhuǎn)染Cx26，Cx32的Hela細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在生長(zhǎng)融合和生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞，順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制作用與細(xì)胞生長(zhǎng)的融合程度有關(guān)。在生長(zhǎng)融合細(xì)胞，順鉑對(duì)集落形成的抑制作用顯著高于生長(zhǎng)未融合細(xì)胞。 2.細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，25μMoleamide組和10μM18-α—GA組的細(xì)胞熒光傳遞功能顯著降低細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在高

7、密度接種細(xì)胞，用25μM oleamide和10μMα—GA抑制GJ功能，5μM順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制作用顯著降低；而在低密度接種細(xì)胞，oleamide，18-α—GA對(duì)順鉑的集落形成抑制作用無明顯影響。 3.細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，10μM RA組細(xì)胞熒光傳遞功能顯著增強(qiáng)。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在高密度接種細(xì)胞，用10μM RA增強(qiáng)GJ功能后，5μM順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制作用顯著增強(qiáng)。而在低密度接種細(xì)胞

8、，RA對(duì)順鉑抑制集落形成的作用無明顯影響。 4.細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，在表達(dá)Cx43的TM4細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，50 nM TPA組的細(xì)胞熒光傳遞功能顯著降低。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在高密度接種細(xì)胞，用50 nM TPA抑制GJ功能，10μM順鉑對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制率明顯增強(qiáng)。 5.Western Blotting結(jié)果顯示：siRNA處理后，TM4細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)明顯降低。細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示：siR

9、NA可明顯抑制由Cx43組成的GJ功能。 結(jié)論： 1.Hela細(xì)胞中，由單一 Cx26、Cx32組成的GJ形成能夠增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性；TM4細(xì)胞中，由Cx43組成的GJ形成能夠降低順鉑的細(xì)胞毒性。 2.抑制由Cx26或Cx32組成的GJ功能可降低順鉑的細(xì)胞毒性；增強(qiáng)由Cx26或Cx32組成的GJ功能可增加順鉑的細(xì)胞毒性。 3.抑制由Cx43組成的GJ功能增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。 第三章Cx26/Cx3

10、2組成的細(xì)胞縫隙連接對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響 目的： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx26/Cx32的Hela細(xì)胞，觀察GJ功能變化對(duì)順鉑誘尋細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)理。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx26/Cx32的HeLa細(xì)胞，采用“Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)”及“Hoechst33258熒光染色法”檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 在生長(zhǎng)融合的細(xì)胞，加doxycycline誘導(dǎo)Cx表達(dá)，獲得有GJ形成的細(xì)

11、胞；觀察GJ形成對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。在GJ形成的細(xì)胞中，用藥物改變GJ功能，觀察GJ功能變化對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx26/Cx32的HeLa細(xì)胞，采用“比色法”檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路中Caspase3，8，9活性。 結(jié)果： 1.“Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)”及“Hoechst33258熒光染色法”結(jié)果均表明，20μM順鉑作用Hela細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。有GJ形

12、成的細(xì)胞，順鉑引起的細(xì)胞凋亡率明顯高于無GJ形成的細(xì)胞。 2.“Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)”及“Hoechst33258熒光染色法”結(jié)果均表明，在GJ形成的Hela細(xì)胞，20μM順鉑作用Hela細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。與單用順鉑組相比，GJ抑制劑oleamide與順鉑合用組的細(xì)胞凋亡率顯著降低。GJ增強(qiáng)劑RA與順鉑合用組的細(xì)胞凋亡率顯著高于順鉑單用組。 3.“比色法”測(cè)定結(jié)果表明，20μM順鉑作

13、用Hela細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Caspase3，8，9活性明顯增加。在有GJ形成的Hela細(xì)胞，順鉑引起的胞內(nèi)Caspase3和Caspase9活性升高程度顯著高于無GJ形成的細(xì)胞。用oleamide抑制GJ功能，顯著降低順鉑升高細(xì)胞內(nèi)Caspase3和Caspase9活性的作用。GJ增強(qiáng)劑RA與順鉑合用，可增強(qiáng)順鉑升高細(xì)胞內(nèi)Caspase3和Caspase9活性的作用。 結(jié)論： 1.由Cx26/Cx32組成的GJ能夠增

14、強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 2.降低GJ功能可減弱順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；升高GJ功能可增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 3.GJ可以通過線粒體途徑增高細(xì)胞內(nèi)Caspase3活性，增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 第四章鎮(zhèn)痛藥對(duì)細(xì)胞縫隙連接的作用及其對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 目的： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx32的Hela細(xì)胞，觀察三種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的鎮(zhèn)痛藥對(duì)GJ功能和順鉑細(xì)胞毒性的影響；并探討鎮(zhèn)痛藥改變GJ功能的作用

15、與其對(duì)順鉑細(xì)胞毒性影響的關(guān)系。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)Cx32的HeLa細(xì)胞中，用“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法”測(cè)定順鉑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。用不同密度接種細(xì)胞的方法，獲得生長(zhǎng)融合細(xì)胞與生長(zhǎng)未融合細(xì)胞。在上述有GJ形成和無GJ形成的細(xì)胞，觀察三種鎮(zhèn)痛藥對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響。 采用“細(xì)胞接種熒光示蹤法”檢測(cè)三種鎮(zhèn)痛藥對(duì)由Cx32組成的GJ功能的影響。 Western Blotting法檢測(cè)三種鎮(zhèn)痛藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)

16、Cx32蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)果： 1.三種鎮(zhèn)痛藥對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的影響 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在生長(zhǎng)融合和生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞，5μM順鉑作用1小時(shí)后，都能夠顯著地降低細(xì)胞集落形成率。在生長(zhǎng)融合的細(xì)胞，10μg/ml曲馬多和氟比洛芬酯與順鉑聯(lián)用，可顯著降低順鉑的細(xì)胞毒性。而在生長(zhǎng)未融合的細(xì)胞，10μg/ml曲馬多和氟比洛芬酯對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性無明顯影響。 2.三種鎮(zhèn)痛藥對(duì)轉(zhuǎn)染Cx32的Hela細(xì)胞GJ功能的

17、影響 細(xì)胞接種熒光示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，曲馬多和氟比洛芬酯組的細(xì)胞熒光傳遞功能顯著降低，結(jié)果表明曲馬多和氟比洛芬能降低由Cx32組成的GJ功能。而同樣濃度的嗎啡對(duì)細(xì)胞熒光傳遞無影響。 3.鎮(zhèn)痛藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)Cx32蛋白表達(dá)的影響 Western Blotting結(jié)果顯示，未用doxycycline誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞不表達(dá)Cx32。與對(duì)照組相比，10μg/ml的曲馬多作用1小時(shí)，可增加Cx32表達(dá)水平。但作用時(shí)