縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊及其與逼尿肌不穩(wěn)定關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的:逼尿肌不穩(wěn)定(detrusor instability,簡稱DI)指儲尿期出現(xiàn)逼尿肌無抑制性收縮,是多種病變(如神經(jīng)疾病、膀胱出口梗阻等)的一個(gè)病理生理環(huán)節(jié),是最常見的一種膀胱功能障礙.迄今為止,對DI的確切發(fā)病原因仍不清楚,且臨床治療效果不盡人意.因此,臨床上迫切需要尋找一種行之有效的治療DI新方法.由于正常逼尿肌收縮主要是由神經(jīng)參與的一種協(xié)調(diào)性活動(dòng),因此逼尿肌細(xì)胞間的興奮傳遞作用并不起主導(dǎo)作用.而在DI發(fā)生過程中,由于逼

2、尿肌本身是一種具有自發(fā)性興奮能力的組織,對于單個(gè)的逼尿肌細(xì)胞而言,當(dāng)其興奮后通過興奮收縮耦聯(lián)要引起整個(gè)膀胱組織協(xié)調(diào)一致收縮,必須經(jīng)過特殊的細(xì)胞間傳遞機(jī)制才能完成.因此,細(xì)胞間的興奮傳遞可能在DI發(fā)生中有極其重要的作用.細(xì)胞間興奮傳遞在心肌、子宮等組織的正常和異常功能活動(dòng)中的作用已為人們所熟悉:存在于心肌細(xì)胞之間的閏盤結(jié)構(gòu)使起搏點(diǎn)的興奮沖動(dòng)能迅速擴(kuò)布于整個(gè)心臟;在子宮平滑肌中縫隙連接(gap junctions, GJ)的形成是足月分娩和

3、早產(chǎn)發(fā)動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而抑制GJ的增加可成功地治療和預(yù)防早產(chǎn)等.目前,對膀胱逼尿肌的興奮傳導(dǎo)所知甚少,國內(nèi)外尚未見細(xì)胞間興奮傳遞與DI關(guān)系的深入研究報(bào)道.因此,研究逼尿肌細(xì)胞間興奮傳遞,將有助于我們了解DI的發(fā)生機(jī)理,并為開發(fā)新型DI治療藥物提供理論依據(jù).本課題通過改良的不全結(jié)扎大鼠膀胱頸部和/或近端尿道的方法,建立了更加穩(wěn)定、合理的大鼠膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)引起的DI動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并

4、從以下幾個(gè)層次逐步深入地對膀胱逼尿肌組織及細(xì)胞進(jìn)行研究.第一,在了解BOO后逼尿肌功能變化的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察逼尿肌細(xì)胞間的超微結(jié)構(gòu)變化,以揭示其功能變化的組織形態(tài)學(xué)基礎(chǔ).第二,在組織水平上從轉(zhuǎn)錄及翻譯水平研究縫隙連接基因(connexin,Cx)及其蛋白表達(dá)與DI的關(guān)系及其生物學(xué)意義,探討細(xì)胞間縫隙連接基因蛋白與DI發(fā)生的關(guān)系.第三,首次利用激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,

5、LSCM)結(jié)合熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP),來動(dòng)態(tài)研究觀測逼尿肌縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)的功能變化,對DI的發(fā)病機(jī)理做進(jìn)一步探討,為臨床治療提供理論性指導(dǎo).第四,利用LSCM及FRAP技術(shù)觀察縫隙連接阻滯劑18β-GA對培養(yǎng)的大鼠DI逼尿肌細(xì)胞G

6、JIC功能的影響,為臨床上采用阻斷細(xì)胞間興奮傳遞來治療DI開辟新的方法及提供理論依據(jù).方法:本實(shí)驗(yàn)通過改良的不全結(jié)扎大鼠膀胱頸部和/或近端尿道的方法,建立了更加穩(wěn)定、合理的大鼠BOO后引起DI的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?根據(jù)尿動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果采用隨機(jī)法將動(dòng)物分為:逼尿肌穩(wěn)定組即正常對照組(control group),逼尿肌不穩(wěn)定組(Detrusor Instability Group).光鏡和透射電鏡下觀察逼尿肌組織及其細(xì)胞間連接的超微結(jié)構(gòu)改變;應(yīng)

7、用RT-PCR技術(shù)及Western-blot方法,從轉(zhuǎn)錄及翻譯水平檢測細(xì)胞間縫隙連接蛋白基因(Cx)及其蛋白在DI中的表達(dá)變化;免疫組織化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞;采用間接免疫熒光染色法,對培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞Cx43表達(dá)進(jìn)行定位分析;利用LSCM及FRAP技術(shù),來研究觀測逼尿肌GJIC的功能變化;觀察縫隙連接阻滯劑18β-GA對培養(yǎng)的大鼠DI逼尿肌細(xì)胞GJIC功能的影響變化.結(jié)果:主要研究結(jié)果如下:1.采用改良法建立的動(dòng)物模型較之以往采用的

8、方法能夠更為確切地模擬臨床上最為常見的BOO類型的疾病.其DI的發(fā)生率高達(dá)80.6﹪.2.光鏡觀察:對照組逼尿肌細(xì)胞之間平行排列,細(xì)胞呈梭形或橢圓形,分布均勻.DI組細(xì)胞增大,形狀多樣,排列紊亂.電鏡觀察:對照組逼尿肌細(xì)胞間連接以中間連接為主,細(xì)胞內(nèi)膜面有附著于胞質(zhì)內(nèi)的微絲.DI組逼尿肌細(xì)胞間連接以縫隙連接為主,肌膜周圍有高電子密度物質(zhì)堆積.3.Cx43、Cx40、Cx45mRNA在DI組及正常對照組膀胱逼尿肌中均有表達(dá).DI組中Cx4

9、3、Cx40mRNA表達(dá)較正常對照組明顯增加,分別增加5.4和2.9倍,各組兩者相比較具有顯著性差異;而Cx45mRNA表達(dá)無顯著性差異.4.DI組逼尿肌組織有高水平的Cx43蛋白表達(dá),與對照組相比較增加3.2倍,兩者相比較具有顯著性差異,與其Cx43mRNA表達(dá)程度相近似.5.間接免疫熒光染色方法發(fā)現(xiàn),DI組逼尿肌細(xì)胞Cx43的表達(dá),呈現(xiàn)較強(qiáng)的FITC綠色熒光,大量強(qiáng)陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞膜上.正常對照組Cx43的表達(dá),FITC熒

10、光產(chǎn)物強(qiáng)度明顯減弱.6.FRAP方法研究膀胱逼尿肌細(xì)胞GJIC功能變化,結(jié)果顯示:熒光標(biāo)記染色膀胱逼尿肌細(xì)胞呈單層貼壁生長.在DI組中,經(jīng)瞬間漂白后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?隨著時(shí)間的推移,熒光逐漸恢復(fù),至第4min時(shí),可見熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù),平均熒光恢復(fù)率為(35.791±0.836)﹪,而單個(gè)細(xì)胞未見熒光強(qiáng)度恢復(fù)現(xiàn)象.正常對照組在相同的時(shí)間內(nèi),漂白細(xì)胞熒光恢復(fù)不明顯,平均熒光恢復(fù)率為(8.645±0.673)﹪.在漂白后的第4min時(shí),

11、兩組平均熒光恢復(fù)率相比較,DI組顯著高于對照組,兩者具有顯著性差異.表明DI逼尿肌細(xì)胞間興奮傳遞增強(qiáng).7.不同濃度的18β-GA(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L)作用于DI組培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞2小時(shí)后,明顯降低逼尿肌細(xì)胞的熒光恢復(fù)率,其熒光恢復(fù)率分別為20.254﹪、12.812﹪、7.094﹪、6.235﹪和3.182﹪,且呈濃度依賴關(guān)系.8.同一濃度18β-GA(40μmol/

12、L)作用于DI組培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞,處理不同時(shí)間(1h、2h、3h和4h)后,其熒光恢復(fù)率分別為8.152﹪、7.289﹪、7.094﹪和6.694﹪,且與作用時(shí)間無明顯依賴關(guān)系.9.移除18β-GA處理后不同時(shí)間DI組培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞GJIC功能變化.10μmol/L18β-GA的低濃度組,熒光恢復(fù)較快,在18β-GA作用(2h)被移除后不同時(shí)間0分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘內(nèi),其熒光恢復(fù)率分別為:16.236﹪、22.186﹪、35

13、.465﹪和37.824﹪;而160μmol/L18β-GA的高濃度組,熒光恢復(fù)較慢,在18β-GA作用(2h)被移除后不同時(shí)間0分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘內(nèi),其熒光恢復(fù)率分別為:4.386﹪、8.267﹪、16.489﹪和20.526﹪.說明18β-GA藥物作用具有可恢復(fù)性和安全性.結(jié)論:1.縫隙連接是逼尿肌細(xì)胞間興奮傳遞的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);2. 本研究首次采用FRAP技術(shù)從功能上證明DI逼尿肌GJIC增強(qiáng);3. DI逼尿肌細(xì)胞間