逼尿肌不穩(wěn)定中Ryanodine受體通道與自發(fā)興奮收縮關(guān)系的實驗研究.pdf

1、目的：逼尿肌不穩(wěn)定(detrusorinstability；DI)中存在諸多因素變化，很多研究提示這種自發(fā)興奮和收縮活性的升高有一定肌源性基礎(chǔ)。逼尿肌肌漿網(wǎng)上的ryanodine受體(ryanodinereceptor；RyR)是平滑肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)中一個重要的有調(diào)節(jié)作用的Ca2+通道，它的作用包括在局部釋放短暫的鈣閃爍(Ca2+sparks)，鈣閃爍激活細胞膜上鈣依賴鉀通道(Ca2+-activatedK+channel；Kca)

2、和負反饋調(diào)節(jié)電壓依賴型Ca2+通道(voltage-dependentCa2+channel；VDCC)，從而也相應的調(diào)節(jié)逼尿肌的自發(fā)性收縮。在本研究中，比較分析了近端尿路結(jié)扎法及遠端尿路結(jié)扎法形成兩種梗阻后模型的特點，為DI模型選擇應用提供依據(jù)；在引入cocktail神經(jīng)受體阻滯劑混合液的基礎(chǔ)上，調(diào)查它對DI離體逼尿肌自發(fā)收縮的改變特征，為真正形成去神經(jīng)影響的肌源性收縮研究提供更好的基礎(chǔ)；考察了RyR通道的mRNA、蛋白表達改變和Ry

3、R的相應功能變化，探討它的改變與DI中膀胱自發(fā)收縮升高之間的可能聯(lián)系。 材料和方法：①通過近端及遠端尿道結(jié)扎兩種方法形成Wistar大鼠的下尿路梗阻，約8周后進行充盈性膀胱測壓確認DI大鼠模型。統(tǒng)計比較兩種方法和正常對照的膀胱濕重、DI大鼠數(shù)量、被排除大鼠的數(shù)量(包括死亡、感染、結(jié)石和漏尿)、非DI大鼠數(shù)量、膀胱容量、最大膀胱壓指標。②新鮮摘取大鼠膀胱，分離獲得離體平滑細肌條，進行一定初張力下的等長收縮實驗，收縮紀錄包括電刺激下

4、的收縮反應和不同混合液、試劑干預下離體孵浴的逼尿肌條自發(fā)收縮變化特征。③通過RT-PCR實驗測定DI逼尿肌組織的RyR亞型表達；半定量RT-PCR實驗和westernblot分析確認RyR的mRNA及蛋白兩種水平的表達在DI與正常對照之間的差異。 結(jié)果：①近端尿道結(jié)扎法DI模型的成功率高于遠端尿道結(jié)扎法，但無統(tǒng)計差異；在排除的因素中，死亡、感染及結(jié)石的情況相似，而漏尿發(fā)生近端法顯著低于遠端法。②兩方法DI模型的膀胱濕重、容量及最

5、大膀胱壓指標與正常對照組比，都存在差異顯著。③在DI離體逼尿肌條紀錄實驗中，為使得離體逼尿肌從僅僅“去中樞神經(jīng)”狀態(tài)，到進一步的“去神經(jīng)”狀態(tài)，有效消除局部神經(jīng)的作用，引入一種含有膀胱組織神經(jīng)受體阻滯劑混合液cocktail后，發(fā)現(xiàn)DI的自發(fā)收縮有一定變化，但仍然持續(xù)存在。④通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)DI逼尿肌組織中RyR只表達RyR2亞型，和正常對照比無亞型變化。⑤與正常對照相比，半定量RT-PCR實驗和westernblot分析顯示R

6、yR的mRNA和蛋白表達在DI膀胱平滑肌組織中都顯著降低。⑥在cocktail-PSS液孵浴中，已有穩(wěn)定自發(fā)性收縮的離體逼尿肌條紀錄，當加入RyR阻滯劑ryanodine后，正常組自發(fā)收縮的頻率顯著升高，且升高后的頻率特征和DI組頻率比較無顯著差異；而DI組在ryanodine給予后自發(fā)收縮改變不顯著。⑦Caffeine應用后顯示能顯著抑制自發(fā)收縮活性，無論是在DI還是正常離體細肌條紀錄中。⑧在L-型Ca2+通道阻滯劑nimodipin

7、e給予后，除了剩下有微小收縮節(jié)律特征外，DI中的自發(fā)收縮紀錄幾乎被消除。 結(jié)論：①遠端尿道結(jié)扎法存在漏尿發(fā)生率較高的缺點，但這兩種方法都是形成梗阻后DI模型的有效途徑。②引入cocktail神經(jīng)受體阻滯劑混合液，有效的消除了局部神經(jīng)的作用，證明離體逼尿肌的自發(fā)性收縮仍然存在，這進一步表明自發(fā)收縮具有“肌源性”基礎(chǔ)。③本研究分析認為RyR在正常逼尿肌的自發(fā)收縮中起到負性調(diào)節(jié)作用，提示可能原因在于RyR通道的“鈣閃爍”激活膜上Kca