整合素β3亞基與DI逼尿肌細胞鈣通道關(guān)系的實驗研究.pdf

1、背景及目的：逼尿肌不穩(wěn)定(Detrusorinstability，DI)是常見的一種膀胱功能障礙，常引起尿頻、尿急、急迫性尿失禁等臨床癥狀，嚴重者可導(dǎo)致腎臟、輸尿管積水和腎功能損害。DI的發(fā)病機理尚不清楚，一直存在著神經(jīng)源性和肌源性的爭論。近年來資料顯示逼尿肌具有自律性，DI與逼尿肌自發(fā)興奮能力增強有關(guān)，發(fā)生DI的最終環(huán)節(jié)是逼尿肌細胞的興奮性增高，是一種肌源性的興奮改變。 Ca2+在逼尿肌細胞的興奮發(fā)生與調(diào)節(jié)機制中起著關(guān)鍵作用。

2、作為次級信號分子在逼尿肌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起非常重要的作用，對逼尿肌舒縮功能的調(diào)節(jié)在很大程度上取決于對Ca2+的調(diào)節(jié)。逼尿肌細胞興奮的前提是Ca2+內(nèi)流入胞，導(dǎo)致膜電位發(fā)生改變，使電壓依賴性離子通道激活，細胞去極化；同時，Ca2+發(fā)揮第二信使作用，激活其它依賴性離子通道與受體，共同參與細胞動作電位的引發(fā)；另外膀胱逼尿肌的收縮也依賴于逼尿肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高。 整合素(Integrin)作為一種跨膜蛋白普遍存在于多種組織細胞，

3、是由α及β亞基通過非共價鍵組成的異二聚體蛋白受體家族，它不是單純的黏附分子，它還參與了一種雙向的信號傳遞過程：將信息從細胞外基質(zhì)傳遞到細胞內(nèi)部，同時細胞內(nèi)部的事件也可以影響它們和配體之間的親和性。近年來在心肌細胞、血管平滑肌細胞中發(fā)現(xiàn)，整合素受體可介導(dǎo)Ca2+電流信號。 本課題以此為切入點，觀察正常及DI逼尿肌中整合素β3亞基的表達，研究整合素β3亞基對逼尿肌細胞Ca2+通道功能的影響，以探討整合素β3亞基對逼尿肌細胞興奮性的影

4、響。 方法：本實驗通過膀胱頸不全結(jié)扎的方法，建立了穩(wěn)定、合理的大鼠BOO后引起DI的動物實驗?zāi)Ｐ?。在清醒狀態(tài)下膀胱測壓，根據(jù)測壓結(jié)果分為：逼尿肌穩(wěn)定組即正常對照組(controlgroup)、逼尿肌不穩(wěn)定組(Detrusorinstabilitygroup)。采用膠原酶消化法急性分離、培養(yǎng)逼尿肌細胞，并采用免疫組化法鑒定逼尿肌細胞。應(yīng)用免疫組化法、RT-PCR及Westernblotting方法，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測整合素β3亞

5、基基因及其蛋白在DI逼尿肌中的表達變化。采用激光共聚焦技術(shù)動態(tài)檢測整合素β3亞基對逼尿肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，運用膜片鉗技術(shù)檢測整合素β3亞基對逼尿肌細胞Ca2+電流的影響。 結(jié)果：主要研究結(jié)果如下： 1、采用膀胱頸不全結(jié)扎的方法建立的動物模型可穩(wěn)定、合理的模擬BOO所致的逼尿肌不穩(wěn)定(DI)。 2、整合素β3mRNA在DI及正常組膀胱逼尿肌中均有表達。DI組中整合素β3mRNA表達較正常明顯增加，兩組相比較

6、具有顯著性差異。 3、DI組逼尿肌組織中有高水平的整合素β3蛋白表達，與對照組相比較增加2.6倍，兩組相比較具有顯著性差異。 4、激光共聚焦動態(tài)檢測逼尿肌細胞內(nèi)Ca2+濃度，細胞外液加入整合素β3單抗后，細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低。 5、細胞外液加入T型鈣通道阻滯劑NiCl2，再加入整合素β3單抗，可觀察到細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低。 6、細胞外液加入L型鈣通道阻滯劑nefedipine，再加入整合素β3

7、單抗，可觀察到細胞內(nèi)Ca2+濃度無顯著變化。 7、運用膜片鉗技術(shù)，細胞外液加入整合素β3單抗后，細胞膜Ca2+電流明顯降低。 結(jié)論： 1、整合素β3亞基在正常對照組及DI組中均有表達，在DI組中的表達明顯高于正常對照組，兩組之間相差顯著。 2、在正常及DI逼尿肌細胞中均可以觀察到整合素β3單抗可以影響細胞的鈣通道，這種影響是有選擇性的，只影響了L-型鈣通道的活性。 3、整合素β3單抗可抑制逼尿肌細