siRNA干擾檢測(cè)整合素α3的功能.pdf

1、目的： 整合素(integrin)是表達(dá)在細(xì)胞膜上作為細(xì)胞外基質(zhì)受體的異二聚體，它有α和β兩個(gè)亞基組成。到目前為止，人們已報(bào)道的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有18種α亞基和8種β亞基。這些α和β亞基一共有24種組合。整合素對(duì)細(xì)胞的黏附、移行、增殖、分化、極性、有絲分裂、凋亡等都有著不可或缺的作用，因?yàn)樗?fù)責(zé)這些過程中的細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的信號(hào)傳導(dǎo)過程。人皮膚組織中主要的整合素是α6β4、α2β1和α3β1。α6β4僅僅表達(dá)在表皮

2、與真皮的交界處，而α2β1和α3β1主要表達(dá)在基底角質(zhì)細(xì)胞的頂部和側(cè)面。作為半橋粒的組成成分之一以及層粘連蛋白332的受體，α6β4對(duì)于表皮錨定到真皮是必不可少的。α6敲除或者β4敲除的老鼠死亡于圍產(chǎn)期。在臨床上，α6或者β4發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致表皮剝脫性大皰征，突出的臨床表現(xiàn)為表皮從真皮脫離從而形成大皰。在這種病理狀態(tài)下，層粘連蛋白的另外一個(gè)受體α3β1并沒有代償α6β4的功能失調(diào)。因此，這預(yù)示著α3β1有不同與α6β4的功能。本研究通過

3、應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，下調(diào)HaCaT細(xì)胞整合素α3的表達(dá)，探討了整合素α3對(duì)HaCaT細(xì)胞的表型變化、黏附能力、增殖能力、移行能力、蛋白表達(dá)變化等的作用，以及涉及的分子機(jī)制。 方法： 應(yīng)用角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。通過應(yīng)用轉(zhuǎn)化試劑，從公司購(gòu)買的雙鏈siRNA序列被轉(zhuǎn)化入HaCaT細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)用相差顯微鏡技術(shù)觀察轉(zhuǎn)化后的群體細(xì)胞和單個(gè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。通過Western技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞膜上鈣黏著蛋白、17型膠原蛋白

4、、整合素α6β4、整合素α2β1，細(xì)胞膜下調(diào)解蛋白：踝蛋白、整合素連接激酶、樁蛋白、紐蛋白、Rho GTP酶，信號(hào)分子：FAK、ERK、β—連環(huán)蛋白，以及細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白、微管蛋白等的變化。通過免疫熒光染色可以看到細(xì)胞形態(tài)和骨架蛋白等的變化。 結(jié)果: HaCaT細(xì)胞在應(yīng)用siRNA整合素α3下調(diào)之后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了很大變化，同時(shí)細(xì)胞的移動(dòng)能力也增強(qiáng)。在siRNA下調(diào)整合素α3后的HaCaT細(xì)胞中鈣黏著蛋白表達(dá)不變，在分

5、布上都沒有明顯變化，而整合素α2β1顯著增高，同時(shí)α6β4降低。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白FAK和ERK是整合素下游被激活的蛋白。整合素α3對(duì)纖粘連蛋白的表達(dá)有上調(diào)作用，同時(shí)可以輕微增加層粘連蛋白332的表達(dá)。 結(jié)論: 整合素α3是表皮細(xì)胞上非常重要的蛋白。整合素α3可以控制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)其他整合素的表達(dá)，并且激活FAK和ERK。同時(shí)整合素α3可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(層粘連蛋白和纖粘連蛋白)的表達(dá)。因此整合素α3有可能是皮膚的愈合過