尖吻蝮蛇去整合素基因克隆與功能分析.pdf

1、研究目的：抗血小板藥物是抗血栓藥物中非常重要的一類，血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa(即整合素α2bβ3)阻斷藥是第三代抗血小板藥，它可阻斷血小板凝集的最終通路，不僅具有極強(qiáng)的抗血小板凝集作用，而且不會(huì)增加出血危險(xiǎn)性。目前應(yīng)用于臨床的GPⅡb/Ⅲa阻斷藥主要以阿昔單抗、埃替非巴肽、替羅非班為代表，但這些藥物來源困難，國(guó)內(nèi)應(yīng)用目前主要依賴進(jìn)口，價(jià)格居高不下，很難滿足我國(guó)普通民眾的醫(yī)療需要，因此迫切需要我們自己研發(fā)一種可大量制備，工藝簡(jiǎn)便，

2、成本低廉的抗血小板新藥。 蛇毒中含多種具有生物活性的蛋白質(zhì)，在抗血栓、止血、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等多方面具有良好的應(yīng)用前景。蛇毒去整合素是蛇毒前金屬蛋白酶原的加工產(chǎn)物，它可阻斷α2bβ3、αvβ3、α5β1整合素與其配體結(jié)合，具有抑制血小板聚集、抗腫瘤、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等功能。蛇毒成分復(fù)雜，從蛇毒中直接分離目的蛋白不但難度高、工藝繁瑣，而且蛇資源日益潰乏，蛇毒來源受限，若應(yīng)用分子生物學(xué)方法體外表達(dá)蛇毒蛋白，則可大大降低生產(chǎn)成本，提高

3、蛋白質(zhì)產(chǎn)量。 基于以上目的，我們從廣西產(chǎn)尖吻蝮蛇毒腺中提取RNA，應(yīng)用基因工程方法克隆表達(dá)一種新的去整合素，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步分析。 研究?jī)?nèi)容與結(jié)果： 1.尖吻蝮蛇去整合素基因克隆與序列分析 本研究從廣西產(chǎn)尖吻蝮蛇毒腺組織提取了總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得了cDNA序列，擴(kuò)增出了243bp的基因片段，并構(gòu)建了其克隆質(zhì)粒pMD-dis。序列分析表明，該片斷包含一個(gè)編碼73個(gè)氨基酸殘基的219bp蛇毒去整合

4、素基因，經(jīng)Blast檢索，該去整合素基因和其它蛇毒去整合素的基因同源性最高為92％，推導(dǎo)氨基酸序列的同源性最高為86％，但它含有蛇毒去整合素典型的RGD三肽基序及12個(gè)位置和數(shù)量保守的半胱氨酸殘基，所形成的6對(duì)保守二硫鍵維持其高級(jí)結(jié)構(gòu)。2.原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)表達(dá)載體多克隆酶切位點(diǎn)信息重新設(shè)計(jì)引物，用新設(shè)計(jì)的引物再次擴(kuò)增獲得的去整合素基因片斷，經(jīng)酶切處理后插入pMAL-p2x載體的XmnⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建了原核

5、表達(dá)質(zhì)粒pMAL-dis，由于選用的載體帶有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的malE基因，表達(dá)出的融合蛋白帶有MBP標(biāo)簽。 3.融合蛋白的表達(dá)與純化 將構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入M15工程菌后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白約為50kD左右，符合預(yù)期大小。在37℃誘導(dǎo)時(shí)融合蛋白主要以包涵體形式存在，而經(jīng)16℃低溫誘導(dǎo)后，融合蛋白以可溶性表達(dá)為主。由于融合蛋白中的MBP對(duì)麥芽糖和直鏈淀粉具有高度親和性，我們選用了A

6、mylose樹脂柱對(duì)它進(jìn)行純化，結(jié)果顯示，經(jīng)過初步親和純化的蛋白中雖然仍含有少許其它雜蛋白，但以去整合素融合蛋白為主，純度較高。 4.融合蛋白體外抑制血小板聚集活性初步分析 本研究對(duì)初步純化的融合蛋白進(jìn)行了體外血小板聚集抑制試驗(yàn)，以經(jīng)同樣處理未插入外源基因的載體表達(dá)蛋白為對(duì)照，結(jié)果表明，重組融合蛋白在終濃度為25μg/ml時(shí)即可抑制血小板聚集，50μg/ml時(shí)血小板聚集活性幾乎完全喪失，而對(duì)照蛋白在相同劑量條件下對(duì)血小板