尖吻蝮蛇血凝酶的生化及免疫學(xué)特性.pdf

1、研究背景與目的:
　　 蛇毒類凝血酶(thrombin-like enzymes，TLEs)是蛇毒中與凝血酶作用機(jī)制部分相似的一類蛋白水解酶。它們屬于絲氨酸蛋白酶，能夠水解纖維蛋白原為纖維蛋白，具有體外促凝，體內(nèi)降纖的作用。蛇毒類凝血酶因其臨床應(yīng)用價(jià)值而被廣泛研究，如瑞士產(chǎn)止血?jiǎng)┝⒅寡≧eptilase，商品名）就是從巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox Moojeni)中提取出的類凝血酶，國(guó)內(nèi)外已廣泛用于出血性疾病及手

2、術(shù)前后出血的臨床防治。
　　 我國(guó)對(duì)尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他們于1971年和1972年相繼分離出兩個(gè)類凝血酶組分，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)均有不同程度的抗凝作用。1993-2005年，唐松山等經(jīng)過12年的努力，從尖吻蝮蛇蛇毒中獲得了5個(gè)新的類凝血酶，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的研究。尖吻蝮蛇血凝酶也是一種從尖吻蝮蛇毒液中提取分離出來的蛇毒類凝血酶，目前研究顯示該酶具有良好的止血作用。20

3、09年北京康辰醫(yī)藥股份有限公司將其作為國(guó)家一類新藥上市銷售，商品名“蘇靈”，代號(hào)Saculin。該凝血酶是迄今為止我國(guó)上市產(chǎn)品中唯一完成全部氨基酸測(cè)序的單一組分蛇毒類止血藥，其止血效果良好，而且不良反應(yīng)輕，耐受性好。
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)Saculin作為一種類凝血酶的部分生化特性及其裂解纖維蛋白原作用進(jìn)行了研究，明確了該酶的作用特點(diǎn)。同時(shí)，對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究，建立了尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗體檢測(cè)的間接ELISA法，并將其應(yīng)用于臨

4、床血清抗體的檢測(cè)。
　　 方法和內(nèi)容:
　　 1.尖吻蝮蛇血凝酶的生化特性研究
　　 1.1 pH值對(duì)酶凝血作用的影響
　　 將Saculin溶于pH值從4-9的緩沖液中，每次分別各取0.2 mL的8 U/mLSaculin溶液與0.2 mL的牛血漿混合，血凝儀測(cè)定其凝血時(shí)間，確定Saculin的最適pH值。
　　 1.2溫度對(duì)酶凝血作用的影響
　　 將1mL的Saculin水溶液與1 m

5、L的牛血漿分別于不同溫度(20-50℃)下孵育3min后于玻璃試管中混合，此時(shí)開始計(jì)時(shí)至剛開始出現(xiàn)渾濁為終點(diǎn)，記錄凝血時(shí)間，以確定Saculin的最適溫度。
　　 1.3 Ca2+對(duì)酶凝血作用的影響
　　 用注射用水配制8 mg/mL人纖維蛋白原溶液和1 U/mL Saculin溶液，37℃孵育3min后分別取等量100μL混合，并在混合液中加入20μL不同濃度的CaCl2溶液，使混合液中CaCl2的濃度為0.45-9.

6、0 mM，血凝儀測(cè)其凝固時(shí)間，以確定Ca2+對(duì)Saculin凝固纖維蛋白原作用的影響。
　　 1.4尖吻蝮蛇血凝酶釋放纖維蛋白肽作用
　　 以0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.4)緩沖液分別配制20 mg/mL人纖維蛋白原溶液、4 U/mL Saculin溶液、8 U/mL人凝血酶溶液。以上溶液配制好以后均于37℃充分水浴后使用。每次取4 U/mL Saculin溶液、8 U/mL人凝血酶溶液各1mL，均加

7、入人纖維蛋白原溶液0.5mL混合均勻，37℃下分別孵育10 min、30 min、1h、2h、10h。每個(gè)反應(yīng)體系孵育凝固后的產(chǎn)物，均于100℃沸水中煮5min以終止反應(yīng)，產(chǎn)物13000 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)行高效液相色譜分析，查看其裂解的肽片段，并以纖維蛋白肽A(FpA)、纖維蛋白肽B(FpB)標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。
　　 2.尖吻蝮蛇血凝酶免疫學(xué)特性研究
　　 2.1多克隆抗體制備
　　 取體重2kg左

8、右的雄性新西蘭兔，于免疫前耳靜脈取血2mL，分離制備血清，-20℃冷凍保存作為對(duì)照。初次免疫將1 mg尖吻蝮蛇血凝酶溶于3mL生理鹽水，與等體積的福氏完全佐劑超聲乳化均勻后，對(duì)新西蘭兔進(jìn)行背部及肩胛部皮內(nèi)、皮下多點(diǎn)注射（3 mL/只）。3周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫注射，將0.5 mg尖吻蝮蛇血凝酶溶于3mL生理鹽水，與等體積福氏不完全佐劑超聲乳化后，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射(3mL/只)，以后每隔2周進(jìn)行同樣的加強(qiáng)免疫注射一次，共3次。初次免疫及每次加強(qiáng)

9、免疫5-7天后均于兔耳緣靜脈采血2mL制備血清。用雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定血清的抗體效價(jià)，以檢驗(yàn)是否有抗體產(chǎn)生，最后一次免疫10d后，從頸動(dòng)脈取全血約100 mL，室溫凝固后置4℃冰箱冷凍保存4h，離心分離血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2.2抗體滴度測(cè)定
　　 采用雙向免疫擴(kuò)散法，以0.05 mol/L pH7.8的磷酸緩沖溶液(PBS)配制1％瓊脂溶膠，待瓊脂粉完全溶解后，加至培養(yǎng)皿中。臨用前以打孔器打孔，6個(gè)周邊孔圍繞

10、1個(gè)中心孔，中心孔加入0.5 mg/mL尖吻蝮蛇血凝酶溶液20μL，周邊孔加入20μL抗血清，抗血清以pH7.8的PBS進(jìn)行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀釋。37℃恒溫水浴箱擴(kuò)散18-24 h，觀察抗體孔與抗原孔間有無沉淀線。
　　 2.3抗體的純化
　　 采用硫酸銨沉淀法，取用生理鹽水稀釋的血清，邊攪拌邊加入飽和硫酸銨，4℃沉淀3h，10000 rpm離心20 min，棄上清，取沉淀溶于生理鹽水后，重

11、復(fù)上述步驟，將沉淀溶于生理鹽水后裝入透析袋，用生理鹽水透析至無NH4+存在。所得溶液經(jīng)5000 rpm離心30min，上清即為純化的抗體液，置-20℃保存。
　　 2.4間接ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)
　　 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適宜的抗原包被濃度，將尖吻蝮蛇血凝酶溶于0.05 mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液中包被96孔酶標(biāo)板，4℃放置過夜。經(jīng)過封閉、洗板后加入不同稀釋度的陽(yáng)性血清（尖吻蝮蛇凝血酶抗血清），陰性血清（無抗體）及

12、稀釋液各100μL/孔，37℃孵育2h，洗板后加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃溫育1h。取出后充分洗滌，加入顯色底物TMB應(yīng)用液顯色，然后用2 mol/LH2SO4溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450值。
　　 2.5抗體特異性鑒定
　　 將尖吻蝮蛇血凝酶抗原溶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后根據(jù)目的蛋白分子量大小及蛋白Marker的指示，切取所需凝膠轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，經(jīng)過

13、封閉、孵育一抗、孵育酶標(biāo)二抗、洗膜后，孵育顯色底物，并進(jìn)行曝光顯影，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 3.臨床試驗(yàn)受試者血清抗體檢測(cè)
　　 3.1血清中抗Saculin抗體檢測(cè)方法學(xué)的建立
　　 參考2.4中尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗體檢測(cè)方法及結(jié)果，建立檢測(cè)人血清中抗尖吻蝮蛇血凝酶抗體的間接ELISA法的最佳實(shí)驗(yàn)條件，并重復(fù)10次檢測(cè)此方法學(xué)的精密度。從待檢陰性血清樣品中隨機(jī)抽取四份樣品，分別進(jìn)行5倍、10倍、50倍和100

14、倍稀釋后，進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，根據(jù)測(cè)得的OD值，確定待檢血清稀釋倍數(shù)。
　　 3.2間接ELISA法檢測(cè)人血清cut-off值的確定
　　 參照3.1確定的實(shí)驗(yàn)條件，將所獲得的232份未注射尖吻蝮蛇血凝酶者血清樣品進(jìn)行稀釋后，測(cè)定其OD值，利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得結(jié)果繪制OD值分布曲線，建立此方法學(xué)檢測(cè)人血清抗Saculin抗體的陰性值參考范圍，確定其cut-off值。
　　 3.3間接ELISA法檢測(cè)S

15、aculin注射前后人抗體水平變化
　　 參照3.1確定的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)尖吻蝮蛇血凝酶臨床實(shí)驗(yàn)受試者血清進(jìn)行檢測(cè)，并在每次的檢測(cè)中均加入自制的兔抗Saculin抗體陽(yáng)性血清、陰性血清作為系統(tǒng)檢測(cè)對(duì)照。以給藥前的稀釋血清作為陰性對(duì)照，給藥后相應(yīng)稀釋度的待測(cè)血清OD值與陰性對(duì)照OD值相比較，升高2.1倍者判為陽(yáng)性，判為陽(yáng)性的最高稀釋度即為血清的抗體效價(jià)。
　　 結(jié)果與結(jié)論:
　　 1.尖吻蝮蛇血凝酶的最適pH值為5.5

16、。
　　 2.尖吻蝮蛇血凝酶的最適溫度為35℃左右，接近人體的正常生理溫度。
　　 3.隨著Ca2+濃度的不斷增加，尖吻蝮蛇血凝酶所導(dǎo)致的纖維蛋白原溶液凝固時(shí)間縮短，說明Ca2+的存在有利于尖吻蝮蛇血凝酶的凝血活性。
　　 4.Saculin與人纖維蛋白原作用時(shí)，能很快釋放出FpA片段，其保留時(shí)間為5.3min，并且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，能釋放出少量的FpB，其保留時(shí)間為7.5 min。
　　 5.通過免疫

17、新西蘭兔成功制備了尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗體，雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體滴度高達(dá)1∶32，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定血清效價(jià)高達(dá)1∶6553600，免疫印跡法鑒定證明該抗體為尖吻蝮蛇血凝酶特異性抗體，其對(duì)尖吻蝮蛇血凝酶具有專一性。
　　 6.用于尖吻蝮蛇血凝酶臨床試驗(yàn)受試者血清抗體檢測(cè)的間接ELISA法，血清不同稀釋度檢測(cè)結(jié)果的變異度均小于5％，說明該方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。血清經(jīng)50、100倍稀釋時(shí)，OD值較低，而5倍稀釋時(shí)，OD