尖吻蝮蛇毒單組分凝血酶樣酶的分離純化.pdf

1、血栓性疾病發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高,嚴(yán)重危害人類健康。藥物治療是血栓性疾病的主要治療手段。常用的抗栓藥物有抗凝血藥、抗血小板藥、溶栓藥和蛇毒制劑等。在蛇毒制劑中凝血酶樣酶選擇性降解纖維蛋白原,使之變成可溶性纖維蛋白,后者繼而被降解,最后纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除,經(jīng)尿液排泄,從而降低血漿纖維蛋白原含量繼而降低血液粘滯度而發(fā)揮抗栓作用。蘄蛇酶是從尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom,AAV)

2、分離純化的凝血酶樣酶,是我國第一個(gè)按新藥審批規(guī)定全面完成研究資料后由國家正式批準(zhǔn)生產(chǎn)的蛇毒制劑。由于受當(dāng)時(shí)分離純化技術(shù)限制,蘄蛇酶并非單一蛋白組分藥品,而是2-3個(gè)同工酶組成。此外經(jīng)十多年的臨床使用表明蘄蛇酶是安全有效的藥物,但它對(duì)血小板有一過性抑制作用,使少數(shù)病人血小板減少。本課題擬采用新的工藝從尖吻蝮蛇毒中分離單一組分蘄蛇酶并觀察其對(duì)血小板的影響。
　　1.尖吻蝮蛇毒凝血酶樣酶的分離純化
　　應(yīng)用Superdex 75凝

3、膠過濾色譜,從尖吻蝮蛇粗毒中分離得到5個(gè)蛋白峰;其中蛋白峰Ⅱ體外凝血酶活性最強(qiáng),暫定名為AAV-Ⅱ;該組分再經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換色譜純化得到6個(gè)蛋白峰,其中蛋白峰3體外凝血酶活性最強(qiáng),暫定名為AAV-Ⅱ3;該組分最后經(jīng)Superdex 30凝膠色譜純化得一個(gè)電泳純蛋白組分,暫定名為AAV-Ⅱ3-1。
　　2.純度分析
　　尖吻蝮蛇粗毒經(jīng)上述三步層析,分離純化后各峰蛋白經(jīng)電泳分析。經(jīng)SDS

4、-PAGE蛋白電泳鑒定發(fā)現(xiàn),AAV-Ⅱ3-1呈單一條蛋白區(qū)帶,從AAV-Ⅱ3-1和Marker在SDS-PAGE蛋白電泳凝膠上的相對(duì)位置,得出AAV-Ⅱ3-1的分子量接近25kD。
　　3.AAV-Ⅱ3-1對(duì)SD大鼠外周血象的影響
　　經(jīng)大鼠隨機(jī)平行對(duì)照試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)AAV-Ⅱ3-1對(duì)大鼠血小板、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白等數(shù)量的影響,與生理鹽水組相比沒有顯著差異(p>0.05),提示試驗(yàn)劑量的AAV-Ⅱ3-1沒有影響外周血象